第一部分:microRNA和microRNA生物合成通路基因中的SNPs与复杂疾病的遗传关联研究以往大量遗传关联研究发现蛋白编码基因中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与多种复杂疾病的易感性、临床转归以及个体化用药等显著相关,但是鲜见具有重要调控功能的非编码基因如microRNA(miRNA, miR)以及miRNA生物合成通路基因中的SNP的遗传关联研究报道。已知miRNA在肝癌、鼻咽癌和脓毒症等复杂疾病的发生发展中发挥重要的作用。因此,我们采用病例-对照或传递/不平衡(transmission/disequilibrium test, TDT)的研究策略,针对miRNA基因以及miRNA生物合成通路基因中的SNP(统称为miRNA相关的SNP,miR-SNPs),系统开展了其与肝癌、鼻咽癌和脓毒症的遗传易感性和病程进展之间的遗传关联研究,主要结果如下:1、miRNA基因以及miRNA生物合成通路基因中SNP的选择。我们通过数据库搜索发现,已注释的705个人类pre-miRNAs(2009年4月,Release 13.0版)中,在142个pre-miRNAs中存在总计186个SNPs。进一步通过DNA重测序证实其中52个SNPs在中国汉族人群中的次要等位频率(minor allele frequency, MAF) > 1%。同时,通过基于功能性SNP和单体型标签SNP(haplotype tagging SNP, htSNP)的选择原则,筛选了miRNA生物合成通路中的14个基因中的97个SNPs。最终总计有149个miR-SNPs进入了后续的遗传关联研究。2、发现miR-SNPs与HBV相关肝癌的遗传易感性显著相关。我们使用SNPStream和TaqMan基因分型技术,在招募自广西的701个HBV相关肝癌病例-对照(340个病例,360个对照)个体和招募自广西的215个非HBV相关肝癌病例和对照(107个病例,108个对照)个体中对149个miR-SNPs进行了基因分型分析。在控制混杂因素的条件下,以非条件性Logistic回归模型计算基因型与肝癌发生风险之间的遗传相关性。我们发现,2个pre-miRNA中的SNPs(即hsa-mir-1283-1 rs57111412和hsa-mir-1908 rs174561)、3个miRNA生物合成通路基因中的SNP(s即EIF2C2 rs4961226、RAN rs7132224和PACT rs3752689)与HBV相关肝癌的易感性之间存在显著的关联,提示hsa-mir-1283-1、hsa-mir-1908、EIF2C2、RAN和PACT是肝癌的易感基因。另外,5个pre-miRNA中的SNPs和4个miRNA生物合成通路基因中的SNPs与非HBV相关肝癌的易感性显著相关,但是在招募自广东的353个非HBV相关肝癌的病例-对照(174个病例,179个对照)个体中上述9个SNPs没有得到重复验证。本课题首次系统研究了miR-SNPs与肝癌易感性的遗传相关性,为进一步探讨miRNA基因以及miRNA生物合成通路基因在肝癌发生中的分子遗传学机制提供了线索。3、揭示miR-SNPs与鼻咽癌的遗传易感性和严重程度显著相关。我们使用SNPStream、Sequenom和TaqMan基因分型技术,在招募自广西的1891个鼻咽癌病例-对照(855个病例,1036个对照)个体中对149个miR-SNPs进行了基因分型分析。对于在广西人群中与鼻咽癌的发生风险和病程进展显著关联的51个miR-SNPs,我们又进一步在另一独立的招募自广东的1969个鼻咽癌病例-对照(997个病例,972个对照)个体中进行了验证。结果发现52个pre-miRNA中的SNPs中,2个SNPs(即hsa-mir-548j rs4822739和hsa-mir-149 rs2292832)与鼻咽癌的发生风险显著相关,4个SNPs(即hsa-mir-1307 rs7911488、hsa-mir-149 rs2292832、hsa-mir-196a-2 rs11614913和hsa-mir-453 rs56103835)与鼻咽癌的淋巴结转移显著相关;97个miRNA生物合成通路基因中的SNPs中,2个SNP(s即RNASEN rs524138和rs7731057)与鼻咽癌的发生风险显著相关,3个SNPs(即DGCR8 rs11089328、EIF2C2 rs2977464和RAN rs7132224)与鼻咽癌的侵袭能力显著相关,2个SNPs(即EIF2C2 rs2977469和rs3928672)与鼻咽癌的淋巴结转移显著相关。结合前人的文献报道,我们推测上述SNPs可能主要影响miRNA的加工成熟过程,使得miRNA的调控机制发生异常,进而影响了鼻咽癌的发生和发展。我们拟对上述发现的与鼻咽癌的发生发展显著相关的―易感基因‖和―易感多态性位点‖开展系统的功能研究,以期揭示遗传学关联背后的分子机制,同时为预警或预测鼻咽癌的发生风险和临床转归提供候选生物学指标。4、揭示hsa-mir-146a与脓毒症的遗传易感性显著相关。我们采用SNPStream和TaqMan基因分型技术,在招募自郑州的515个脓毒症病例-对照(255个病例,260个对照)个体中对52个pre-miRNA中的SNPs进行了分型分析,对于在郑州人群中与脓毒症的发生风险和临床转归显著关联的13个SNPs,进一步在另一独立的招募自大连的598个脓毒症癌病例-对照(299个病例,299个对照)个体中进行了验证。我们发现,hsa-mir-146a中的功能性SNP位点(rs2910164)与脓毒症的发生风险显著相关,携带杂合基因型(C/G)的个体发生脓毒症的风险显著高于携带纯合基因型(C/C + G/G)的个体。已有研究表明,miR-146a靶向调控NF-κB通路中的IRAK1和TRAF6,从而负向调节NF-κB介导的炎症反应。另有研究发现,携带C/G基因型的个体中NF-κB通路活性显著上调,促进炎症反应。我们因此得出结论,在中国人群中hsa-mir-146a的遗传多态性能够影响个体对脓毒症的易感性。第二部分:采用“组学”和整合生物学的方法研究肝癌发生发展的机理肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)(简称肝癌)是世界上常见的恶性肿瘤之一,全世界肝癌患者的50%发生在我国。肝癌具有恶性程度高、病程进展迅速、易复发和转移、生存期短的特点。因此,急需发现肝癌的致病基因及其调控网络,为肝癌的预防和治疗奠定基础。我们首先制定了严格的入选和排除标准,收集了具备完整的临床和社会人口学资料的40例肝癌病例的癌组织、配对癌旁组织和外周全血样本。对40对癌组织和配对癌旁组织,我们采用Affymetrix SNP 6.0芯片检测了基因组拷贝数变异(copy number alteration, CNA)、采用Affymetrix外显子芯片检测了mRNA表达谱,采用二代深度测序技术检测了miRNA表达谱。在对上述各―组学‖数据进行严格的质量控制后,我们系统分析了各―组学‖数据中的基因组和转录组信息。我们采用GISTIC和JISTIC两种分析方法分析了基因组拷贝数变异数据,发现肝癌组织中发生了37个显著的体细胞基因组拷贝数变异区域(其中扩增型CNAs 15个,缺失型CNAs 27个),共包含了662个基因(其中一些是已知的肿瘤基因,如MYC、CCND1、RB1、CDKN2A、PTEN和AXIN1等)。采用SVA分析方法对mRNA表达谱数据进行分析,经Bonferroni校正后发现有543个显著差异表达的基因(其中上调279个,下调264个)。使用SAM分析方法分析了miRNA表达谱,发现了79个显著差异表达的miRNAs(其中上调41个,下调38个),其中包含了以往文献报道的在肝癌中差异表达的miR-192、-21、-30d、-199a-3p、-199b-3p和let-7c等44个miRNAs。进而,我们采用整合生物学分析的策略,使用CONEXIC分析方法整合分析了基因组拷贝数变异与mRNA表达谱数据,发现了40个候选的肝癌驱动基因及其靶基因模块,其中包含了1个已知的肝癌致病基因(MTAP)和3个肿瘤相关基因(FZR1、RRM2B和CLPTM1L)。另外36个为此次新发现的候选的肝癌驱动基因。例如,EXOC2和ILF3共调控一个由168个基因组成的模块,参与了Src通路、MAPK通路、Cyclin通路、p53通路和Ras通路等,与肝癌的发生发展密切相关。我们还整合分析了miRNA表达谱和mRNA表达谱数据,发现了414对显著差异表达的miRNA/mRNA,其中包含26个显著差异表达的miRNAs和310个显著差异表达的基因。其中miR-128的表达差异最为显著,它调控了65个靶基因(其中BMI1为以往文献报道的经过实验验证的miR-128的靶基因),参与了VEGF通路、AKT通路、MAPK通路和EGF通路等与肿瘤的发生发展密切相关的信号通路,提示其与肝癌的发生紧密相关。总之,我们通过系统的研究发现40个肝癌的候选驱动基因和26个miRNAs以及受其调控的靶基因模块。本研究将有助于揭示肝癌的致病机理,并且为发现能用于肝癌早期诊断和分子分型的生物标志物,发现新的药物靶标等奠定基础,为中国人群中高发的肝癌的诊断、预防和新药的研发提供理论依据。相关的CNAs、miRNAs和mRNAs的功能还需要今后系统的功能研究来确定。