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甲壳素是自然界仅次于纤维素的第二大可再利用有机资源,甲壳素脱乙酰后得到壳聚糖,甲壳低聚糖是甲壳素或壳聚糖降解后产生的一类低聚合度、可溶于水的壳寡糖。同甲壳素和壳聚糖相比,甲壳低聚糖具有更好的水溶性和生物相容性,生理特性更加独特和优越,具有保湿、抑菌、抗肿瘤、提高免疫、调节血脂和胆固醇等一系列的生理功能。传统方法制备甲壳低聚糖存在污染大、能耗高、产品质量不稳定等缺点,而酶法制备甲壳低聚糖条件温和,过程易于控制,对环境无污染而成为目前研究的热点。本论文通过从土壤中筛选分离产壳聚糖降解特效酶的菌株,并对该菌株产酶及酶解条件进行了研究,为酶法制备甲壳低聚糖打下基础。
主要实验结果如下:
1.采用以壳聚糖为唯一碳源的选择性平板筛选培养基,从33份土样中分离筛选得到17株产壳聚糖酶的菌株,对其中5株透明圈与菌落直径比值较大的菌进行初步鉴定,结果表明,1株为细菌,其余4株为放线菌。
2.分别采用细菌和放线菌较合适的培养基,对初筛选出的5株菌斜面保藏和摇瓶复筛,采用DNS法测定酶活,得到1株产壳聚糖酶能力较强的菌株CJ-1,酶活可达2.28U/ml。该菌株菌落湿润,表面有光泽,似蜡烛样白色。通过生理生化特征,以及16SrDNA序列分析对其进行鉴定,确定该菌属于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
3.实验表明,CJ-1菌株所产的壳聚糖酶为诱导酶,其最适发酵培养基为以1%壳聚糖为碳源,牛肉膏为氮源,碳源氮源比例为8:1。作为碳源的壳聚糖脱乙酰度越高,对发酵产酶越有利,当脱乙酰度高于90%时,酶活则变化不大。添加表面活性剂可显著提高酶活,最适的表面活性剂为吐温60,最适添加量为0.04%。通过响应面曲线优化后的最佳发酵产酶工艺条件为温度38℃,pH6.5,发酵时间28h,装液量36ml,在此条件下,发酵液的酶活力为3.18U/ml。
4.研究表明,该酶对温度不太稳定,当温度达到70℃时,酶活力损失达90%。pH对酶活稳定性影响不大,在pH4.5-7.5范围内均比较稳定。最适酶解底物为脱乙酰度为90%的壳聚糖。进一步通过实验确定,最佳酶解条件为温度49℃,pH5.8,壳聚糖浓度1.8%。
5.采用薄层色谱和高效液相色谱法对产物进行分析表明,壳聚糖最终被降解为二糖,三糖,四糖和五糖,水解产物中没有单糖和六糖存在。