目的:肝脏是调节机体内多种生理反应,例如糖原贮存、脂肪代谢、蛋白分泌和药物代谢等的重要器官。而肝实质细胞作为肝脏最主要的细胞类型,对于维持肝脏代谢、解毒和稳态等功能起着不可或缺的作用。因此,肝细胞是研究肝脏代谢、肝疾病发病机制、肝移植和药物筛选等重要的细胞模型。随着啮齿类动物肝细胞系的建立和应用,筛选出很多新型的肝病治疗药物,但是因为遗传背景的差异,药物治疗在实际应用中达不到预期效果。因此更能代表人类遗传背景的灵长类动物越来越多地被应用于基础和临床医学研究。普通狨猴(common marmoset),作为新大陆猴,因为体型小、繁殖率高、生理特性与人类类似等特点,已经被成功应用于帕金森综合症等神经退化性疾病模型。另外,狨猴对肝脏疾病比较敏感,已经被成功地用做GBVB-HCV嵌合病毒猴模型,但是目前还没有可以成功感染嵌合病毒的肝细胞模型,因此狨猴肝细胞系的建立对于肝病及其他疾病的研究和临床转化意义重大。本研究致力于建立具有增殖能力和代谢及体内再生能力的狨猴肝细胞系,以期为人类肝脏疾病的发病机理,药物筛选及治疗等提供良好的灵长类肝细胞模型。方法:1.狨猴原代肝细胞的分离与传代培养:利用胶原酶IV消化2周大流产狨猴肝组织,离心,铺于6孔板。利用威廉姆斯E培养基,同时添加20ng/ml肝细胞生长因子、20ng/ml表皮细胞生长因子、1×胰岛素铁硒传递蛋白、10%10099血清、10μM地塞米松、10%青/链霉素、10%L-谷氨酰胺、75mg牛血清白蛋白、10ng/ml烟酰胺。2.狨猴肝细胞系建系方法的优化:利用慢病毒包装体系ps PAX2和p MD2.G分别包装猴病毒大T抗原和人端粒酶逆转录酶质粒,并且转染原代狨猴肝细胞。通过绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性筛选,以获得成功感染的阳性细胞克隆。3.狨猴肝细胞系的建立和验证:通过检测猴病毒大T抗原转染的原代肝细胞,连续的传代次数、增殖能力和形态学,以证明狨猴肝细胞系的建立。4.狨猴肝细胞系染色体稳定性及成瘤性检测:通过细胞核型的提取、DAPI染色、染色体数目的统计和分型,以证明狨猴肝细胞系在建系过程中是否存在染色体的丢失与重组;通过裸鼠皮下成瘤试验,以证明狨猴肝细胞系是否在建系过程中发生癌化。5.狨猴肝细胞系相关基因表达谱分析:通过半定量RT-PCR和共聚焦显微镜检测,分别从基因和蛋白水平的表达,以验证狨猴肝细胞系在肝脏特异基因的表达情况。6.狨猴肝细胞系超微结构分析和基本生理功能的验证:通过电镜对狨猴肝细胞系的超微结构,包括线粒体、肝糖原和微绒毛等进行观察分析;通过糖原贮存、脂滴形成和吲哚菁绿(ICG)代谢试验,以证明狨猴肝细胞的体外代谢能力。7.狨猴肝细胞系的药物一级代谢和排出功能测试:通过半定量RT-PCR,对肝细胞一级代谢相关基因CYP家族中CYP3A4、CYP1A1、CYP1A2等,进行基底水平表达分析和药物(利福平、3-甲基胆蒽)刺激后相应基因的表达定量分析,以验证狨猴肝细胞系药物一级代谢能力;通过绿色荧光标记CDFDA的摄入定位试验,以证明狨猴肝细胞系是否具有胆管排出能力。8.狨猴肝细胞系在FAH缺陷小鼠上的功能验证:延胡索酰乙酰乙酸水解酶缺陷型小鼠模型(FAH-/-)是一种肝脏代谢疾病小鼠模型,将1x107狨猴肝细胞,通过脾脏移植到FAH-/-小鼠肝脏中。利用FAH和GFP免疫组化染色,以检测细胞移植后小鼠肝功能改善、体重和生存期变化等,与未移植细胞组小鼠比较,以证明狨猴肝细胞系在体内的修复再生能力。9.狨猴肝细胞系干性相关特性的研究:通过检测肝干细胞相关基因的表达和3D培养诱导胆管分化试验,以证明狨猴肝细胞系是否具有肝干细胞的特性。10.狨猴肝细胞其他方面研究:利用CRISPR-Cas9技术,敲除狨猴原代肝细胞中抑癌基因TP53,以确定其对狨猴肝细胞增殖能力和成瘤性的影响。通过裸鼠成瘤试验,以证明TP53基因敲除对狨猴肝细胞癌化的影响。结果:1.成功分离和获取具有肝细胞上皮形态和增殖能力有限的狨猴原代肝细胞。2.建系方法优化试验,确定猴病毒大T抗原慢病毒过表达的方法,建立狨猴肝细胞系效果更佳。3.通过筛选获取6个阳性细胞克隆,其中MHCL-1和MHCL-2细胞克隆可以稳定传代,并且连续培养超过100代以上,确认其无限增殖能力。同时,共聚焦显微镜分析,发现:E-cadherin表达降低和a-SMA表达升高,说明肝细胞系有上皮-间质细胞转化(EMT)发生,但在传代过程中形态无明显变化。4.狨猴肝细胞系染色体染色结果显示:肝细胞系为正常狨猴染色体条数46条,未发现染色体缺失、重组;通过吉姆萨G带染色,将46条染色体分为23对;而裸鼠成瘤性试验结果表明:所获得狨猴肝细胞系不具有成瘤性。5.通过半定量RT-PCR和共聚焦显微镜检测,对狨猴肝细胞系基因表达谱分析结果显示:两个狨猴肝细胞克隆,都表达大部分肝特异性基因,包括ALB、AAT和HNF4A等,但是上皮细胞特异性基因表达减弱,包括CK19、CK7和CK18,证明狨猴肝细胞系虽然形态发生变化,但其肝细胞功能相关基因表达基本正常。6.通过吲哚菁绿(ICG)的摄入和排出、肝糖原染色和油红染色等体外功能试验,证明狨猴肝细胞系具有肝细胞基本特性和生理功能。7.通过检测利福平和3-甲基胆蔥诱导前后,狨猴肝细胞系药物一级代谢相关CYP家族中CYP3A4、1A1和1A2基因的表达水平,证明狨猴肝细胞系表达本底水平CYP,并且在药物刺激下CYP表达增加。这些结果表明该狨猴肝细胞系具有药物一级代谢相关活性。8.通过FAH-/-小鼠体内移植狨猴肝细胞系试验,结果表明:与对照组相比,狨猴肝细胞系可以显著改善5只移植小鼠肝功能、延长其生存期和恢复其体重。FAH和GFP的免疫组化染色,也证明了狨猴肝细胞系具有体内整合和再生能力。9.在狨猴肝细胞干性试验中,通过半定量RT-PCR和共聚焦试验,证明狨猴肝细胞系表达肝干细胞相关基因,包括AFP和SOX9。同时,利用Matrigel和Collagen为基质的3D培养,结果显示:狨猴肝细胞系可以在体外分化为类似胆管的结构,提示狨猴肝细胞系具有肝干细胞的特性。10.在利用Crispr-Cas9在原代肝细胞敲除试验中,通过基因组测序和Western,证明获得TP53-KO狨猴原代肝细胞模型;在裸鼠皮下成瘤试验中,通过病理染色确认类似畸胎瘤的出现,提示TP53的敲除可能会影响狨猴原代肝细胞的分化能力。结论:1、获得了可稳定传代、表达肝特异性基因和染色体正常的狨猴肝细胞系MHCL-1和MHCL-2,且这些肝细胞系不具有致瘤性,为正常狨猴肝细胞。2、狨猴肝细胞系具有肝细胞的基本生理功能,并具备药物一级代谢的能力,可作为药物筛选、药理和毒性测试等体外细胞模型。3、狨猴肝细胞系具有肝脏再生和代谢能力,可以作为肝移植的细胞模型。4、狨猴肝细胞系表现出部分肝干细胞的特性,可用于后续肝干细胞相关研究。