慢病毒介导shRNA靶向沉默VEGF-A乳腺癌细胞株的构建

来源 :徐州医学院 徐州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wodelqm
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目的:通过构建血管内皮生长因子VEGF-A基因RNA干扰慢病毒载体,介导其对VEGF-A基因沉默,筛选并建立VEGF-A基因稳定下调的乳腺癌细胞株。  方法:1.设计三对靶向VEGF-A的shRNA表达序列并连接到慢病毒转移质粒pLB中,成功构建pLB-VEGF-A/shRNA质粒,并经PCR和测序鉴定;2.分别将构建的重组质粒与慢病毒包装质粒pCMVA8.91、被膜蛋白质粒pMD.G通过lipofectamine2000共转染至包装细胞293FT细胞,生产慢病毒颗粒,同时利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达水平来检测其滴度;3.包装产生慢病毒后感染乳腺癌细胞株MCF-7,经流式细胞仪分选出GFP阳性细胞,并收集培养;4.实时荧光定量RT-PCR对VEGF-A在mRNA水平上的沉默效果进行鉴定,并筛选出沉默效果最佳的干扰序列。  结果:1.PCR扩增和测序验证重组质粒pLB-VEGF-A/shRNA1,2,3构建成功;2.重组质粒同另两种包装质粒共转染293FT细胞后生产出的慢病毒颗粒滴度达108IU/ml;3.慢病毒颗粒分别感染MCF-7细胞,与空白对照组相比,三组特异性干扰组感染MCF-7细胞VEGF-A mRNA的表达量均下降,分别降低了(43.42±0.03)%、(68.18±0.02)%、(81.85±0.03)%,差异有统计学意义(P<0.05),其中pLB-VEGF-A/shRNA3组VEGF-A基因沉默效果最明显,表达量下降了(81.85±0.03)%;而阴性对照组与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。  结论:1.成功地构建了携带人VEGF-A基因的慢病毒表达载体;2.成功地筛选出高效VEGF-A/shRNA干扰序列,并且构建了VEGF-A基因稳定下调的乳腺癌工程细胞株MCF-7。
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