研究背景肝纤维化是继发于各种慢性致病因素引起的肝脏损伤和炎症后组织修复过程中的代偿反应,以细胞外基质(extracellular matrix, EMC)在肝内的过量沉积为病理特征,是各种慢性肝病向肝硬化发展所共有的病理改变和必经途径。众多研究表明,局部组织肾素-血管紧张素系统(RAS)与肝纤维化密切相关,RAS在肝纤维化组织中显著上调,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的重要组分,可刺激肝星状细胞增殖和胶原纤维的合成,因此AngⅡ是促肝纤维化的重要物质。近年来,RAS的另一个新发现的重要组分：血管紧张素转换酶2(ACE2)-血管紧张素1-7(Ang(1-7))-Mas受体轴引起人们的关注。该轴对ACE-AngⅡ-ATIR轴具有负调控作用,两个轴之间的平衡状态可能影响了肝纤维化的发展。肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)是肝纤维化发生过程的中的关键细胞。HSC被肝损伤相关的炎症反应激活后,大量增殖分化,分泌过量的细胞外基质,最终引起肝纤维化。HSC主要通过TGF-β/Smad通路激活。TGF-β的受体二聚化后,磷酸化的Smad2/3,在Smad4的参与下启动纤维化的相关基因表达。Smad7可通过抑制Smad2/3的磷酸化抑制该过程。尽管人们对肝纤维化发生的基本病理过程和信号通路已有所了解,但临床上仍缺少治疗肝纤维化的特效药物。针对TGF-β和SMAD通路的生物抑制剂还停留在实验研究阶段,未能大规模应用于临床。因此,寻找肝纤维化防治过程的新靶点和新策略依然是目前面临的主要挑战。MicroRNA (mirRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,由呈发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。miRNA参与多种疾病的病理过程,是疾病重要的候选诊断标志和潜在的治疗靶点。miRNA在细胞内具有多种重要的调节作用,能对靶基因进行转录后调控。每个miRNA可以有多个靶基因,而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达,也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。miRNA能够与其序列互补的mRNA分子相结合,甚至可以与特定的DNA片断结合,导致目的基因的沉默。这种方式是机体调节基因表达的一个重要策略。据推测,miRNA调节人类三分之一的基因。mirRNA的研究多见于肿瘤方面,在器官纤维化方面的研究还相对较少。本论文主要针对AngⅡ是否通过促进mir-21表达,调控SMAD通路关键信号分子,进而促进肝纤维化展开研究,阐明mir-21在肝纤维化发生过程中的关键作用。同时探明AngⅡ激活转录因子AP-1以及SMAD3、SMAD2从而诱导mir-21的表达作用机理。讨论mir-21作为治疗肝纤维化的潜在靶点。目的研究在体内以及体外实验中,AngⅡ是否通过促进mir-21表达,调控SMAD通路关键信号分子,进而促进肝纤维化展开研究,阐明mir-21在肝纤维化发生过程中的关键作用,同时探明AngⅡ激活转录因子AP-1以及SMAD3、SMAD2从而诱导mir-21的表达作用机理。方法常规培养的大鼠肝星状细胞T6细胞系,根据实验目的不同进行下述不同的实验：1、不同浓度的AngⅡ分别刺激大鼠肝星状细胞T6细胞系6小时,通过荧光定量PCR检测到micro-21的表达量的变化；大鼠肝星状细胞T6细胞系分为对照组、10-5mol/L AngⅡ处理组、10-7mol/L AngⅡ处理组、10-9mol/L AngⅡ处理组,实验重复3次。2、10-7mol/L AngⅡ分别于不同时间点刺激大鼠肝星状细胞T6细胞系,通过荧光定量PCR检测到micro-21的表达量的变化,大鼠肝星状细胞T6细胞系分为AngⅡ刺激0小时组、AngⅡ刺激6小时组、AngⅡ刺激24小时组,实验重复3次。3、不同浓度的Ang (1-7)分别刺激大鼠肝星状细胞T6细胞系6小时,通过荧光定量PCR检测到micro-21的表达量的变化；大鼠肝星状细胞T6细胞系分为对照组、10-5mol/L Ang (1-7)处理组、10-7mol/L Ang (1-7)处理组、10-9mol/L Ang (1-7)处理组,实验重复3次。4、10-7mol/L Ang (1-7)分别于不同时间点刺激大鼠肝星状细胞T6细胞系,通过荧光定量PCR检测到micro-21的表达量的变化,大鼠肝星状细胞T6细胞系分为AngⅡ刺激0小时组、Ang (1-7)刺激6小时组、Ang (1-7)刺激24小时组,实验重复3次5、大鼠肝星状细胞T6细胞系分为对照组、AngⅡ刺激组、Ang (1-7)刺激组、AngⅡ+Ang (1-7)刺激组,通过荧光定量PCR检测到micro-21的表达量的变化,实验重复3次。6、分别用NC、microRNA-21前体(pre-microRNA-21)或者microRNA-21抑制剂(anti-microRNA-21)转染大鼠肝星状细胞T6细胞系72小时,用免疫印迹方法(Western Blot)法检测α-平滑肌蛋白(α-SMA)、结缔组织(CTGF)、 SMAD7、Ⅰ型胶原(type Ⅰ collagen)蛋白水平的变化,实验重复3次。7、大鼠肝星状细胞T6细胞系分为pre-microRNA-21转染对照+AngⅡ刺激0分钟组、pre-microRNA-21转染+AngⅡ刺激0分钟、pre-mi croRNA-21转染对照+AngII刺激5分钟组、pre-microRNA-21转染+AngⅡ刺激5分钟组,以及anti-microRNA-21转染对照+AngII刺激0分钟组、anti-microRNA-21转染+AngII刺激0分钟组、anti-microRNA-21转染对照+AngII刺激5分钟、anti-microRNA-21转染+AngII刺激5分钟组,用免疫印迹方法(Western Blot)法检测磷酸化的SMAD2(p-SMA2)、磷酸化的SMAD3(p-SMA3)蛋白表达水平的变化,实验重复3次。8、大鼠肝星状细胞T6细胞系分为对照组、SMAD2-siRNA组、对照+AngⅡ刺激组SMAD2-siRNA+AngⅡ刺激组,或者对照组、SMAD3-siRNA组、对照+AngⅡ刺激组、SMAD3-siRNA+AngⅡ刺激组,培养6小时后通过荧光定量PCR检测到microRNA-21的表达量的变化,实验重复3次。9、大鼠肝星状细胞T6细胞系分为野生质粒转染对照+转染microRNA-21mimics组、转染Smad73’UTR野生型质粒+转染microRNA-21mimics组,或者突变质粒转染对照+转染microRNA-21mimics组、转染Smad73’UTR突变型质粒+转染microRNA-21mimics组,培养48小时后检测细胞的海肾素荧光与萤火虫荧光比值变化,miRNA-21特点主要是通过与靶基因3’UTR结合来调控靶基因的表达。将Smad7基因的3’UTR区克隆至载体上海肾荧光素酶基因(hRluc)下游位点,以海肾荧光素酶基因作为报告基因,以萤火虫荧光素酶基因(hLuc)作为内参基因,通过检测海肾荧光素酶活性的相对变化情况来鉴定miRNA-21对该基因是否有调控作用。实验重复3次。Wistar大鼠根据不同实验目的进行下述不同的实验：10、Wistar大鼠分为假手术组(SHAM组)、胆管结扎组(BDL组)、以及BDL+Ang(1-7)组,4周后取肝组织,通过HE染色评价肝组织纤维化评分、masson染色计算胶原面积、做羟脯氨酸测定、α-SMA的免疫组化、microRNA-21的原位杂交试验。11、Wistar大鼠分为假手术组(SHAM组)、胆管结扎组(BDL组)、以及BDL+Ang (1-7)组,4周后取肝组织,提取总RNA,通过荧光定量PCR检测各组microRNA-21基因表达量的变化,判断Ang(1-7)对胆管结扎大鼠肝纤维化的抑制作用。12.Wistar大鼠分为假手术组(SHAM组).AngII刺激组、Ang(1-7)刺激组、AngII+Ang(1-7)刺激组,4周后取肝组织,通过HE染色评价肝组织纤维化评分、masson染色计算胶原面积、做羟脯氨酸测定、α-SMA的免疫组化。13.Wistar大鼠分为假手术组(SHAM组)、AngⅡ刺激组、Ang(1-7)刺激组、AngⅡ+Ang(1-7)刺激组,分别用生理盐水、AngII.Ang(1-7).AngII+Ang(1-7)以每小时25ug/kg速度持续腹腔泵入,4周后取大鼠肝组织,提取总RNA,通过荧光定量PCR检测各组microRNA-21表达量的变化,初步证实AngⅡ可以促进microRNA-21表达进而引起肝纤维化。结果1、与对照组相比,10-5mol/L AngⅡ、10-7mol/L AngⅡ、10-9mol/L AngⅡ刺激大鼠肝星状细胞T6细胞系6小时后,细胞中microRNA-21的表达量均明显增加(P<0.05,P<0.01,P<0.01),而10-7mol/L AngII刺激大鼠肝星状细胞T6细胞系引起的microRNA-21的表达量增加效果最为显著。2、培养6小时,与control组相比,10-7mol/L AngII刺激大鼠肝星状细胞T6细胞系后,通过荧光定量PCR检测到microRNA-21的表达量明显增高(P<0.05)；培养24小时与培养6小时相比,大鼠肝星状细胞T6microRNA-21的表达量有所下降(P<0.05)。3、与对照组相比,10-7mol/L Ang (1-7)刺激大鼠肝星状细胞T6细胞系6小时后,细胞中microRNA-21的表达量均明显降低(P<0.05),而10-5mol/L Ang (1-7)处理组、10-9mol/L Ang (1-7)处理组刺激大鼠肝星状细胞T6细胞系引起的microRNA-21的表达量无明显改变(P=0.224,P=0.286)。4、培养6小时,与control组相比,10-7mol/L Ang (1-7)刺激大鼠肝星状细胞T6细胞系后,通过荧光定量PCR检测到microRNA-21的表达量明显降低(P<0.001)；培养24小时后,与control组相比,10-7mol/L Ang(1-7)刺激大鼠肝星状细胞T6细胞系后通过荧光定量PCR检测到microRNA-21的表达量无明显改变(P=0.230)；培养6小时与培养24小时相比,大鼠肝星状细胞T6microRNA-21的表达量明显降低(P<0.01)。5、与对照组相比,AngⅡ刺激组中microRNA-21的表达量增加(P<0.001),与AngⅡ刺激组比,AngⅡ+Ang (1-7)刺激组细胞microRNA-21的表达量下降(P<0.001)。6、大鼠肝星状细胞T6细胞系培养72小时后,与对照组相比,用microRNA-21前体(pre-microRNA-21)转染组细胞中α-SMA、CTGF、type Ⅰ collagen蛋白表达增加(P<0.001,P<0.001,P<0.01)而SMAD7蛋白表达降低(P<0.01)。而用microRNA-21抑制剂(anti-microRNA-21)转染组细胞中α-SMA、CTGF、 type Ⅰ collagen蛋白表达降低(P<0.001,P<0.001,P<0.001)而SMAD7蛋白表达升高(P<0.001)。7、与pre-microRNA-21转染对照+AngⅡ刺激0分钟组相比,pre-microRNA-21转染+AngⅡ刺激0分钟组细胞p-SMAD2、p-SMA3蛋白表达增高(P<0.001,P<0.001)；与pre-microRNA-21转染对照+AngⅡ刺激0分钟组相比,pre-microRNA-21转染对照+AngⅡ刺激5分钟组细胞p-SMAD2、p-SMA3蛋白表达增高(P<0.001,P<0.001)；与pre-microRNA-21转染对照+AngⅡ刺激5分钟组相比,pre-microRNA-21转染+AngⅡ刺激5分钟组细胞p-SMAD2、p-SMA3蛋白表达增高(P<0.001,P<0.001),差异有统计学意义；与anti-microRNA-21转染对照+AngⅡ刺激0分钟组相比,anti-microRNA-21转染+AngⅡ刺激0分钟组细胞p-SMAD2、p-SMA3蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)；与anti-microRNA-21转染对照+AngⅡ刺激0分钟组相比,anti-microRNA-21转染对照+AngⅡ刺激5分钟组细胞p-SMAD2、p-SMA3蛋白表达增高(P<0.001,P<0.001)；与anti-microRNA-21转染对照+AngⅡ刺激5分钟组相比,anti-microRNA-21转染+AngⅡ刺激5分钟组细胞p-SMAD2、p-SMA3蛋白表达降低(P<0.001,P<0.001),差异有统计学意义。8、与对照组相比,SMAD2-siRNA组microRNA-21表达量下降(P<0.05)；对照+AngⅡ刺激组microRNA-21表达量增加(P<0.05)。与SMAD2-siRNA组相比,SMAD2-siRNA+AngⅡ刺激组microRNA-21表达量增加(P<0.05),差异有统计学意义；与对照组相比,SMAD3-siRNA组microRNA-21表达量下降(P<0.05)；对照+AngⅡ刺激组microRNA-21表达量升高(P<0.05)。与SMAD3-siRNA组相比,SMAD3-siRNA+AngⅡ刺激组microRNA-21表达量变化不明显(P=0.571),差异无统计学意义。9、培养48小时后,与野生质粒转染对照+转染microRNA-21mimics组相比,转染Smad73’UTR野生型质粒+转染microRNA-21mimics组细胞的海肾素荧光与萤火虫荧光比值降低(P<0.05))；而与突变质粒转染对照+转染microRNA-21mimics组、转染Smad73’UTR突变型质粒+转染microRNA-21mimics组细胞的海肾素荧光与萤火虫荧光比值改变无明显改变(P=0.605)。10、在假手术组(SHAM组)、胆管结扎组(BDL组)、以及BDL+Ang (1-7)组中,与SHAM组相比,BDL组中肝纤维化评分、胶原面积、羟脯氨酸含量、α-SMA的含量均增高(P<0.05)；与BDL组相比,BDL+Ang (1-7)组中肝纤维化评分、胶原面积、羟脯氨酸含量、α-SMA的含量均降低(P<0.05),差异有统计学意义。原位杂交实验分析示：与SHAM组相比,BDL组中表达microRNA-21的细胞明显增多；与BDL组相比,BDL+Ang (1-7)组中表达microRNA-21的细胞明显减少。11、在假手术组(SHAM组)、胆管结扎组(BDL组)、以及BDL+Ang (1-7)组中,与SHAM组相比,BDL组中microRNA-21的表达明显增高(P<0.001)；与BDL组相比,BDL+Ang (1-7)组中microRNA-21的表达明显降低(P<0.001)。12、与SHAM组相比,AngⅡ刺激组大鼠肝组织中肝纤维化评分、胶原面积、羟脯氨酸含量、α-SMA的含量均增高(P<0.05)；与AngⅡ刺激组相比,AngⅡ+Ang(1-7)刺激组大鼠肝组织中肝纤维化评分、胶原面积、羟脯氨酸含量、α-SMA的含量均降低(P<0.05),差异有统计学意义。13、与SHAM组相比,AngⅡ刺激组大鼠肝组织中microRNA-21的表达明显增高(P<0.001),与AngⅡ刺激组相比,AngⅡ+Ang (1-7)刺激组大鼠肝组织中microRNA-21的表达明显降低(P<0.001),差异有统计学意义。结论1、在体外实验中,AngⅡ能促进microRNA-21的表达,作用于其靶基因SMAD7进而调控SMAD通路。Ang (1-7)可以抑制AngⅡ的作用。2、在体内实验中,AngⅡ刺激和胆管结扎能引起肝组织中microRNA-21的表达增高,引起肝纤维化；而Ang (1-7)能抑制AngⅡ刺激和胆管结扎所引起的肝纤维化。