截止到2009年6月2日,高致病性H5N1人禽流感已经蔓延到15个国家和地区,累计感染病例433人,死亡262人,死亡率高达60%。在我国,确诊病例38例,死亡25人,死亡率约为65.8%。另外,伴随着家禽及野生禽类地域分布的变化,目前高致病性H5N1人禽流感病毒已经遍及亚洲以及中东、欧洲、北美、非洲的部分地区,其基因型与抗原性不断变化,哺乳动物宿主范围也在不断扩大。可见人禽流感的防控形势已经异常严峻。为此,WHO提出要加快人禽流感疫苗的研发进程,做好技术储备工作。防控高致病性H5N1人禽流感最有效的手段是疫苗免疫。当前高致病性H5N1人禽流感疫苗主要集中在灭活全病毒疫苗、裂解疫苗、减毒疫苗等方面的研究。已经制备的大流感模式疫苗主要为灭活全病毒和裂解病毒疫苗,实验证明其安全、有效和稳定。然而现有的这类疫苗多为注射免疫,该疫苗可以诱导机体产生较高效价的特异性抗病毒血清中和抗体,但是对于其它亚型病毒的免疫保护效果较差,而且在特殊人群(老人和儿童)免疫效果不十分满意,疫苗接种方式繁琐,不利于人群大规模接种,这些对其疫苗的研制带来了挑战。近年来发展起来的透皮免疫无疑为上述问题的解决提供了新的思路。透皮免疫作为无针注射免疫途径中的一种,在预防流感的大流行方面具有很大优势:提高疫苗的接种速度、增加接种的安全性及依从性、不需要专业人员等。另外,透皮免疫的有效性也已被证实,但其机制尚不十分明确,有人提出以下理论:因皮肤中存在大量的抗原递呈细胞尤其是朗格汉斯细胞,摄取并加工抗原,将其递呈给T和B细胞,从而激起全身和粘膜免疫应答。朗格汉斯细胞尽管数量仅占人皮肤细胞总数的2%,但其表面积却占皮肤总面积的25%左右。朗格汉斯细胞的密度及其抗原递呈功能无疑为疫苗的透皮传递提供了理想的靶标。本研究选用WHO推荐的H5N1疫苗株-----A/Vietnam/H5N1-PR8/CDC-RG制备的灭活全病毒疫苗抗原,以霍乱毒素(CT)、霍乱毒素B亚单位(CTB)、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)、MF59、CpG1826、CpG2006为佐剂,以乙醇、丙二醇、二甲基亚砜、维甲酸、油酸为促渗剂,透皮免疫Balb/c小鼠,通过评价其安全性、有效性,从而筛选出有效的透皮免疫佐剂和促渗剂,并对该透皮疫苗免疫应答的效果进行观察。另外鉴于大肠杆菌不耐热肠毒素不易购得的问题,本研究还就其制备进行了探索。本研究分为三部分:1 .高致病性H5N1人禽流感透皮疫苗佐剂的初步筛选:选用A/Vietnam/H5N1-PR8/CDC-RG灭活全病毒疫苗抗原,设计以下两个方面的实验:(1)佐剂的筛选:以CT、CTB、LT、MF59、CpG1826、CpG2006为佐剂,与50μg抗原充分混合,调整抗原浓度为1.0μg/μl,以油酸作为促渗剂,透皮免疫Balb/c小鼠,通过检测血清IgG抗体及其抗体亚型、血抑效价、肺灌洗液、鼻灌洗液、阴道灌洗液中的IgG、sIgA抗体效价,从而初步筛选到两种有效的透皮免疫佐剂--------CT、LT。(2)rLT的制备及其生物活性的验证:以E. coli E24377A菌株的基因组为模扳,构建表达载体pET28a-LTA、pET28a-LTB和pET22b-LTB,对蛋白进行诱导表达及纯化后,以1:5(n/n)的比例将LTA与LTB混合,最终制得了rLT全毒素,经SDS-PAGE、WB、GM-ELISA、CHO细胞毒性试验以及MALDI-TOF-MS等方法对其分子量及活性进行了验证,还通过动物实验对其佐剂活性作了验证,结果表明该方法制备的rLT不仅具有较好的毒性,而且在透皮免疫应答过程中是较好的佐剂,与(1)中使用的LT相比较,佐剂效果相当。2.高致病性H5N1人禽流感透皮疫苗促渗剂的初步筛选:仍然选用A/Vietnam/H5N1-PR8/CDC-RG灭活全病毒疫苗抗原,选用10μg rLT作为佐剂,分别以乙醇、丙二醇、二甲基亚砜(DMSO)、维甲酸、油酸作为促渗剂,透皮免疫Balb/c小鼠,从安全性和有效性这两个方面对这5种促渗剂进行了初步评价,从而初步筛选到三种安全、有效的促渗剂--------油酸、DMSO、维甲酸。此外,还对促渗剂处理前后的皮肤病理改变情况进行了观察,实验结果表明不同的促渗剂对固有层的紊乱程度差异较大,油酸、DMSO、维甲酸去除角质层的效果较好。但因DMSO具有较强的刺激性气味,在实际应用中难以推广,因此优选油酸和维甲酸作为高致病性H5N1人禽流感透皮疫苗的促渗剂。3.高致病性H5N1人禽流感透皮疫苗免疫应答效果的初步观察:选用油酸作为促渗剂,对抗原与佐剂之间的量效关系进行摸索,并对透皮免疫应答的效果进行初步观察。以不同剂量的抗原—5μg、10μg、25μg、50μg、100μg与不同剂量的rLT 0μg、1μg、5μg、10μg、25μg、50μg、100μg混合吸附后,选用油酸作为促渗剂,透皮免疫Balb/c小鼠,通过检测免疫前后小鼠血清IgG抗体及其抗体亚型、血凝抑制效价,肺灌洗液、鼻灌洗液、阴道灌洗液中的IgG、sIgA抗体效价,从而初步确定抗原剂量与佐剂剂量的最佳配比为抗原(HA含量)50μg,rLT10μg。并将该组的透皮免疫应答效果与PBS组、单用抗原组、注射组以及滴鼻组进行比较,结果发现透皮免疫组的血清IgG抗体效价以及血抑效价要明显高于PBS组、单用抗原组,但是低于注射组和滴鼻组;粘膜免疫应答强度与滴鼻组相比无统计学意义;同时ELISPOT实验结果还表明高致病性H5N1人禽流感透皮疫苗诱导的CD4+ T细胞免疫应答以Th2型细胞免疫应答为主。由此可见,高致病性H5N1人禽流感透皮疫苗不仅能够诱导较强的体液免疫应答,而且能诱导粘膜免疫应答和细胞免疫应答。结论:在本研究中,从佐剂、促渗剂、抗原、免疫应答这四个方面对高致病性H5N1人禽流感透皮疫苗进行了初步研究。研究发现,在高致病性H5N1人禽流感疫苗透皮免疫的小鼠模型中,初步筛选并确定了透皮免疫佐剂是CT、LT,促渗剂是油酸、维甲酸,抗原剂量与佐剂rLT剂量的最佳配比为抗原50μg,rLT10μg,免疫三次后能够诱导较好的免疫应答效果。此外,成功表达了大肠杆菌不耐热肠毒素,并且通过实验证明其具有较强的毒性和较好的佐剂效果。另外,实验结果还表明透皮免疫不仅能够诱导较好的体液免疫应答,而且能够诱导粘膜免疫应答和细胞免疫应答,从而为高致病性H5N1人禽流感透皮疫苗的研究奠定了良好的基础,同时也为其它透皮疫苗的研究提供了思路。