超分辨成像显微镜已经成为观察活细胞和组织不可或缺的工具。但是目前用于超分辨成像的仪器虽然已经突破了衍射极限，但仍没达到分子水平（1～5nm）的分辨率。而用于超分辨成像的光激活荧光蛋白、光转换荧光蛋白和光开关荧光蛋白却有比较大的发展空间。通过改造这些荧光蛋白，得到光物理和光化学性质更好的荧光蛋白探针，以提高超分辨成像的分辨率，从而实现在分子水平上实时观察生物学现象。在第二章，对于选择合适的RFP来标记膜蛋白，我们给出一种简单快捷的方法。Kd值是体外表征蛋白聚集性质的一个重要参数，而RFPs的Kd值还不完全，因而我们首次测定了常见红色荧光蛋白mOrange1，mOrange2，mCherry、mApple，mKate2和TagRFP的Kd值。当用单体荧光蛋白标记膜蛋白时，会产生一些亮的点状聚集体。但是目前对于这种点状聚集体的成因并没有解释。在本章，当mGFP，mOrange2，mCherry，mApple，mKate2和TagRFP与对环境敏感的Orai1融合表达后，发现除了荧光蛋白本身的性质之外，细胞环境的pH值以及蛋白的pKa值对点状聚集体的形成比较重要，并且我们还发现这些亮的点状聚集体定位在溶酶体。综合所有的因素，在常见的红色荧光蛋白中mOrange2是标记膜蛋白的最佳选择。在第三章，基于宽场照明系统，筛选得到的光稳定荧光蛋白，在宽场荧光显微镜长时间成像中有重要的应用。由于很多有机荧光染料在光照实验中都会被漂白掉，尽管荧光蛋白漂白的速度相对来说比较慢，但是，当需要对同一细胞采集多张图片时，蛋白的光稳定性却成为限制光学成像的主要因素。因此，我们以与mEos3.2同源的mEos2的晶体结构为指导，以mEos3.2为模板，建立突变文库，结合搭建的光照系统，得到了在宽场显微镜下比较稳定的突变体mEos3.2-T58SA60Q，其光稳定性约为mEos3.2的两倍。在第四章，荧光筛选与程序软件相结合，筛选得到发射光谱重叠更少的光转换荧光蛋白在双色PALM成像中会有比较重要的应用。由于mEos3.2为光转换荧光蛋白，红色荧光激发波长为560nm，其红色发射峰有两个：主峰为580nm，副峰为630nm。为了避免mEos3.2与其它荧光蛋白进行双标时发生光谱重叠，我们参照mEos2的晶体结构，选择生色团附近与生色团可能发生相互作用的位点进行突变。再经过搭建的光学系统和普通的宽场荧光显微镜筛选，得到的突变体mEos3.2-F61C P141C T143R在630nm处发射峰强度约为mEos3.2此处发射强度的2/3。