研究背景肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的过继性细胞治疗最早被报道是在1988年,Rosenberg和他的同事首次证实了将TIL做为一种免疫治疗的方法治疗恶性黑色素瘤可以使肿瘤消退。随后关于TIL的研究越来越多,其中应用于临床治疗效果最显著的是恶性黑色素瘤,Rosenberg的团队在2002年一期Science中报道在给患者回输TIL前减少患者自身的淋巴细胞可以使回输TIL治疗有效率提高至50%,而在随后2005年他们的报道中改进回输前临床预处理力方法后患者的治疗有效率可以高至70%。恶性黑色素瘤的传统治疗方法包括IL-2和氮烯哗胺,其治疗有效率仅有15%-25%,而这样比较看来TIL的高治疗有效率使其治疗优势大为突出。肝癌和恶性黑色素瘤一样,也属于免疫原性较强的恶性肿瘤,除了早期手术治疗外,后期没有有效的治疗方法,人们一直在努力尝试使用免疫治疗的手段来治疗肝癌。而免疫治疗除了CIK外TIL开展较少,其很大部分原因在于没有成熟的培养和扩增TIL的方法,技术上的不稳定限制了临床的应用,而本次课题的主要目地就是探索体外培养和扩增原发性肝癌TIL的技术,为TIL应用于临床治疗肝癌打下基础。目的：1.探讨体外大量扩增原发性肝癌TIL的方法。2.初步研究它们的分子表型,检测其分泌细胞因子能力并分析其细胞功能特征。3.观察不同的辐照剂量(0,1,2Gry)对细胞表型及功能的影响。方法：原发性肝癌的标本来源均为手术切除的肿瘤原发灶。这些标本经混合消化酶消化为单个细胞后,应用不连续密度梯度离心法分离其中的淋巴细胞,分瓶种植后进行不同剂量的辐照处理(0,1,2Gry),然后应用2步培养法大量扩增TIL并检测它们的扩增速度。应用流式细胞仪检测不同剂量下扩增的淋巴细胞的分子表型(CD3,CD56,CD4,CD8,CD25,Fox-p3,CD27,CD28), CBA细胞因子检测试剂盒检测这些TIL分泌IFN-γ, TNF-α, IL-4,IL-5,IL-10以及IL-2的基础水平以及植物血凝素(PHA)刺激后这些细胞因子的分泌水平,分析扩增TIL分泌细胞因子的能力及对其功能影响。最后比较经过不同剂量的辐照后TIL表型的变化以及细胞因子分泌的变化,由此推断辐照对TIL功能的影响。结果：1.20例原发性肝癌标本有18例能成功培养TIL并将其扩增到1010个数量级。2.扩增的TIL中CD3+细胞的比例为95.7%±7.4%,CD3+CD56+细胞的比例为28.5%±11.7%, CD3+CD4+细胞的比例为32.5%±19.6%,CD3+CD8+细胞的比例为62.5%±29.1%。未检测到CD27的表达,CD3+CD28+细胞的比例为71.1%±28.8%。CD4+CD25+细胞占CD3+细胞的2.1%±0.6%,CD4+Fox-p3+细胞占CD3+细胞的2.6%±0.9%。3.细胞因子分泌经检测扩增TILs分泌IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-5, IL-4的基础平均水平分别为2147.9±406.6pg/ml,3.6±1.3pg/ml,13.9±4.6pg/ml, 2265.1±712.4pg/ml,21.6±5.9pg/ml,而经过PHA刺激后其相应分泌水平分别为：12019±3150.6pg/ml,6634.0±1763.5pg/ml,29.2±3.7pg/ml,8624.3±609.1pg/ml,112.4±34.5pg/ml。4.辐照对TIL细胞表型以及分泌细胞因子功能的影响。不同的样本对辐照的反应不同,进行辐照的10个以CD8+细胞为主的TIL样本中有8个样本可以通过流式检测到细胞群的规律性变化,这8个TIL样本随着辐照剂量的增加CD3+CD8+T细胞,CD3+CD28+T细胞有减少趋势,这其中有6个样本CD3+CD56+T细胞群对着辐照剂量的增加而减少,而另外2个CD3+CD56+T细胞群则在1Gry的辐照剂量下最多,而后是未经辐照的和2Gry剂量。5.进一步检测TIL分泌细胞因子发现,经辐照不同剂量后的TIL分泌细胞因子的量也有变化,而具体变化趋势则是IFN-γ,TNF-α, IL-5随着CD3+CD56+T细胞的变化而变化,在6个随着辐照剂量增加而减少的CD3+CD56+T细胞的样本中,IFN-γ, TNF-α, IL-5的分泌量也随之减少,而在另外2个样本中则是1Gry辐照量的TIL分泌IFN-γ, TNF-α, IL-5最多,其次分别为未辐照的和2Gry剂量的。而且这些变化趋势可以出现在无论有没有进行PHA刺激的TIL内。结论：1.使用两步扩增法可以成功扩增原发性肝癌组织内浸润的淋巴细胞到1010个数量级且细胞免疫活性和功能均较好。2.低剂量辐照损伤肿瘤浸润淋巴细胞功能。