近年来,随着成像技术的发展,以荧光探针为基础的荧光成像技术已成为一种可视化监测目标物的理想工具,具有操作简单、灵敏度和时空分辨率高等优点,因此受到了各界广泛的关注和应用。以双光子荧光探针为基础的双光子荧光成像是利用飞秒（fs）脉冲激光在近红外区域（700～900 nm）同时产生两个光子来激发荧光团。与单光子荧光成像相比,该技术可提高目标样品的可视化深度,降低自发荧光和光散射。因此,双光子荧光成像在化学生物学领域备受关注。本论文以双光子荧光探针为主要研究方向,生物活性物种为研究对象,设计并合成了三例双光子荧光探针,并对其荧光响应及生物成像进行了研究。（1）设计并合成了具有ESIPT效应和罗丹明开闭环两种发光机理的比率型一氧化氮双光子荧光探针TP-NO-P1,该探针以rhodol-HBT偶联染料为荧光团,以邻苯二胺为识别基团。该探针检出限低（51.3 n M）,细胞毒性低且光稳定性好,与NO可特异性结合。共聚焦成像结果显示,该探针可成功用于检测细胞外源性和内源性一氧化氮,也可应用于伤口炎症模型组织中监测NO含量的变化,表明该探针可作为一种用于检测生物体内NO变化的候选材料。（2）设计并合成了一例线粒体定位的双光子比率型超氧阴离子自由基荧光探针HMDP,该探针以香豆素为双光子荧光团、喹啉鎓离子作为线粒体定位基团、二苯基次膦酰基结构作为O2·-的识别基团。该探针响应快速、检出限低（37.2n M）,且对O2·-具有良好的选择性。探针HMDP可用于细胞OGD/R模型中检测O2·-含量的变化,并成功应用于小鼠脑卒中模型的生物成像,表明该探针可用于监测生物体内O2·-的变化。（3）利用GCTPOC作为双光子荧光团、以1-甲基吲哚啉-2,3-二酮作为ONOO-的识别基团,设计并合成了双光子过氧化亚硝酸根荧光探针GCT-ONOO。该探针响应较快、检出限低（13.5 n M）,且对ONOO-具有较高的选择性。探针GCT-ONOO成功应用于检测细胞内源性和外源性ONOO-含量的变化。