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猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)属于疱疹病毒科,与人单纯疱疹病毒(Human simples herpesviruses,HSV)同属α疱疹病毒亚科。PRV在猪群中呈现暴发性流行,可引起妊娠母猪繁殖功能障碍、公猪不育、育肥猪呼吸困难乃至生长停滞,新生仔猪发病尤其严重,死亡率高达100%,是威胁世界养猪业的重要传染病之一。防治本病的关键是阻止病毒侵入宿主细胞,但是,由于对PRV侵入机制缺乏足够的认识,目前还没有能够抑制病毒侵入的药物应用于临床。疱疹病毒侵入宿主细胞是一个需要多种病毒表面囊膜蛋白和宿主细胞表面受体相互作用的过程,HSV1、HSV2、PRV等α疱疹病毒亚科成员参与这一过程的糖蛋白有:gB、gD、gH和gL。gD是一个主要的受体结合蛋白,目前已经发现的HSV gD受体有:HVEM(Herpesvirus entry mediator)、Nectin-1、3-O-S-HS(3-O-sulfonated-heparan sulfate)和CD155蛋白。PRV能够利用Nectin-1作为受体感染细胞,但是HVEM和3-O-S-HS并不影响PRV的感染。也有报道认为另一细胞粘附分子Nectin-2是HSV-2、PRV及某些HSV-1突变体的受体。Nectin-1是一个免疫球蛋白样的黏附分子,通过与同一家族的成员形成同源或异源二聚体参与细胞的黏附过程。过去的研究已经揭示HSV gD与Nectin-1相互作用模式,即gD通过结合在Nectin-1二聚体形成的表面,破坏Nectin-1二聚体的形成。PRV与HSV gD只有大约22%的同源性,然而同样可以结合Nectin-1,其机制目前并不了解。同时,人源Nectin-1和猪源Nectin-1相对保守,PRVgD与二者的结合有何区别等一系列科学问题都有待解决。本研究首先利用CHO-K1细胞评价了猪Nectin-1(SW-nectin-1)、人Nectin-1(HU-nectin-1)和人 HVEM(HU-HVEM)介导 PRV 的侵入。CHO-K1细胞是PRV不敏感细胞,不能介导PRV侵入。结果显示,表面表达了SW-nectin-1和HU-nectin-1分子的CHO细胞,PRV感染后有明显的细胞病变,而表达了 HU-HVEM的CHO细胞没有明显的细胞病变。本研究进一步利用病毒融合系统在细胞水平对PRVgD利用SW-nectin-1、HU-nectin-1和HU-HVEM介导的细胞融合能力进行了定量,将PRV对SW-nectin-1的膜融合设为100%,以此为参照,HU-nectin-1介导的PRV膜融合能力与SW-nectin-1相比没有显著差异。而HU-HVEM不能介导PRV的膜融合。综合以上实验得出结论:PRV gD能够利用猪和人Nectin-1进行细胞融合,而不能利用人HVEM。为评价PRVgD与Nectin-1相互作用能力,本研究在体外表达纯化了PRVgD与Nectin-1蛋白,在蛋白水平进行了相关研究。首先,我们检测了PRV gD是否能在溶液中与Nectin-1形成稳定复合体。将PRV gD单体蛋白、Nectin-1单体蛋白以及PRV gD/Nectin-1混合物蛋白分别流过分子筛,比较蛋白质混合前后出峰位置的差异,再与分子筛层析标准出峰位置对照以及进行SDS-PAGE电泳,结果显示两者可以形成稳定的复合物。然后,利用表面等离子共振技术(SPR)定量测定了 PRVgD与SW-nectin-1、HU-nectin-1的相互作用,其结合亲和力常数(Kd)分别为18.4 nM和16.1 nM,表明两者有非常高的亲和力。为阐明PRV gD的结构特征以及PRV gD与Nectin-1相互作用的模式,利用X-射线晶体学的方法,分别结晶并解析了来源于PRV Becker株的gD蛋白胞外域结构以及PRVgD与SW-nectin-1 IgV结构域的复合物结构。结构显示,PRVgD尽管与与HSV-1/HSV-2同源性较低,但是其空间结构非常相似,即包括了一个Ig样的核心结构及N端和C端loop区结构域。PRV也使用相同的模式来结合Nectin-1受体。具体来说,两个来源的gD蛋白都结合Nectin-1的第一个Ig可变区,而且PRVgD结合Nectin-1的区域恰好处于Nectin-1介导自身二聚化的区域,这种结合模式阻碍了 Nectin-1二聚体的形成,进而破坏Nectin-1二聚体执行的细胞粘附功能。HSV-1/HSV-2 gD N端的loop参与HVEM的结合,从PRV gD结构中发现,其N端比HSV-1/HSV-2明显短18个氨基酸,这样就从结构上解释了为什么PRV不能利用HVEM作为受体。同时,本研究还比较了两种不同长度的PRVgD蛋白(gD284和gD337)与猪和人Nectin-1的亲和力,发现缺乏C端的截短体蛋白gD284比全长的gD337与Nectin-1的亲和力高1个数量级,结果与HSV-1/HSV-2 gD和Nectin-1相互作用情况一致,表明PRV gD与HSV-1/HSV-2gD一样,在结合受体前后C端发生了构象变化,结合受体后C端的融合结构域被暴露,与其它糖蛋白相互作用引起病毒囊膜蛋白与宿主细胞膜的融合---Displayment假说。PRVgD与HU-nectin-1有很高的亲和力,是否可以跨种传播给人,因本研究未能解析PRVgD与HU-nectin-1的结构,为阐明PRVgD与人Nectin-1相互作用模式,本研究模拟了 PRVgD与HU-nectin-1的结构,通过对复合物结构的比较分析,发现HU-Nectin-1与SW-nectin-1与PRV gD相互作用的氨基酸非常保守,故对HU-nectin-1与PRVgD相互作用的氨基酸进行了突变,揭示了 N77,180,M85以及F129是HU-nectin-1与gD相互作用的关键氨基酸,与HU-nectin-1和HSV-1/HSV-2 gD蛋白相互作用完全一致。综上所述,本研究以PRVgD蛋白与其受体Nectin-1作为研究对象,深入探索了蛋白的体外表达、纯化以及结晶方法,尤其是攻克了 PRVgD与Nectin-1共结晶这一世界难题,运用X射线衍射晶体学的方法首次解析了两者的复合体结构,再结合细胞水平以及蛋白质水平的功能实验,彻底揭示了 PRVgD与Nectin-1的相互作用模式,同时还定位了参与这种相互作用的Nectin-1的关键氨基酸位点,这些发现可为疱疹病毒膜融合机制以及PRV致病机制的最终阐明提供重要的理论基础,同时也可为抗病毒药物以及疫苗的研发提供重要的依据。