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近年来,脑卒中在我国的发病率逐年增高,其具有较高的致死率和致残率,给患者及其家庭带来了严重的负担,其中缺血性脑卒中的占比70%以上。临床上针对缺血性脑卒中主要采用静脉溶栓的方式恢复血液再通,然而这一过程又会造成脑缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤。当前临床上针对脑I/R损伤的治疗效果并不理想。并且脑I/R损伤的发生机制复杂,因此进一步阐明脑I/R的病理损伤机制,探寻脑I/R损伤治疗的潜在靶点,具有非常重要的意义。铁死亡是一种铁依赖的脂质过氧化物过度累积导致的细胞死亡形式。近年来大量研究表明靶向抑制铁死亡已经成为减轻脑I/R损伤的一个重要手段。CISD2(CDGSH iron-sulfur domain-containing protein 2,CISD2)是早期神经元分化的标志物之一,近年CISD2在神经系统疾病中的研究愈发广泛,同时又有研究表明上调CISD2可通过抑制胞内的铁超载和降低脂质过氧化水平减轻头颈部肿瘤细胞的铁死亡。然而CISD2在脑I/R损伤中的作用尚不清楚。目的:1.探讨CISD2在小鼠脑I/R损伤中的蛋白表达变化。2.探讨调控CISD2后对小鼠脑I/R损伤的影响。3.探讨上调CISD2抗小鼠脑I/R损伤的具体作用机制。方法:1.在体:为了探究(CDGSH iron-sulfur domain-containing protein 2,CISD2)在抗小鼠脑I/R损伤中的作用,ICR小鼠被随机分为6组(n=10):假手术(Sham)组、脑缺血再灌注损伤(I/R)组、脑缺血再灌注+腺病毒空载体(I/R+AAVNC)组、脑缺血再灌注+CISD2过表达(I/R+AAV-CISD2)组、脑缺血再灌注+慢病毒无序基因(I/R+LV-NC)组和脑缺血再灌注+CISD2干扰(I/R+LV-sh RNA)组;为了探究过表达CISD2抗脑I/R损伤的作用机制,ICR小鼠又被随机分为5组(n=10):假手术(Sham)组、脑缺血再灌注损伤(I/R)组、脑缺血再灌注损伤+CISD2过表达(I/R+AAV-CISD2)组、脑缺血再灌注损伤+Nrf2抑制剂(I/R+ML385)组、脑缺血再灌注+CISD2过表达+Nrf2抑制(I/R+AAV-CISD2+ML385)组。线栓法制备小鼠大脑中动脉栓塞模型(Middle Cerebral Artery Occlusion,MACO)。Longa五分法用来评价小鼠的神经功能障碍。透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)用来观察脑组织中神经细胞内线粒体的形态。尼氏染色法(Nissl Staining Solution)观察神经细胞形态及数量。2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法用来检测脑梗死体积。微板法检测组织内亚铁离子、丙二醛、谷胱甘肽水平。免疫印迹法检测CISD2,Nrf2和铁死亡相关蛋白的表达。2.离体:使用小鼠海马神经元细胞进行离体细胞实验。探讨CISD2在抗OGD/R损伤中的作用,HT22细胞被分为六组:对照(control)组、糖氧剥夺/复氧(OGD/R)组、糖氧剥夺/复氧+CISD2过表达空载体(OGD/R+OE-NC)组、糖氧剥夺/复氧+CISD2过表达(OGD/R+OE)组、糖氧剥夺/复氧+CISD2干扰无序片段(OGD/R+sh RNA-NC)组和糖氧剥夺/复氧+CISD2干扰(OGD/R+sh RNA)组;为了探究过表达CISD2抗HT22细胞OGD/R损伤的作用机制,细胞被分为5组:对照(Control)组、糖氧剥夺/复氧(OGD/R)组、糖氧剥夺/复氧+Nrf2抑制剂(OGD/R+ML385)组、糖氧剥夺/复氧+CISD2过表达(OGD/R+OE)组和糖氧剥夺/复氧+CISD2过表达+Nrf2抑制剂(OGD/R+OE+ML385)组。Calcein-AM/PI双染法检测细胞存活率。Ferro Orange活细胞染色法检测细胞内的亚铁离子水平。流式细胞术检测胞内Lipid Ros水平。免疫印迹法检测胞内CISD2、Nrf2和铁死亡相关蛋白表达。结果:1.神经行为学评分表明:sham组小鼠无神经功能障碍;I/R组较sham组小鼠有显著的神经功能障碍,行为学评分显著升高(p<0.001);相较于I/R+AAVNC组,I/R+AAV-CISD2组神经功能障碍显著缓解,行为学评分显著降低(p<0.01);相较于I/R+LV-NC组,I/R+LV-CISD2组小鼠神经功能障碍显著加重,行为学评分显著升高(p<0.01);相较于I/R+AAV-CISD2组,I/R+AAVCISD2+ML385组小鼠神经功能障碍加重行为学评分显著升高(p<0.01)。2.脑梗死体积结果表明:sham组小鼠无脑梗死体积;相较sham组,I/R组小鼠的脑梗死体积显著增高(p<0.01);相较于I/R+AAV-NC组,I/R+AAV-CISD2组小鼠脑梗死体积显著降低(p<0.001);相较于I/R+LV-NC组,I/R+LVCISD2组小鼠脑梗死体积显著增高(p<0.01);相较于I/R+AAV-CISD2组,I/R+AAV-CISD2+ML385组小鼠脑梗死体积显著增高(p<0.01)。3.尼氏染色结果表明:sham组小鼠脑组织中神经元形态饱满,数量较多;相较sham组,I/R组小鼠脑组织中神经元形态萎缩,数量显著减少;相较于I/R+AAV-NC组,I/R+AAV-CISD2组小鼠脑组织中神经元形态损伤趋于改善,神经元数量显著性增多。4.透射电子显微镜结果表明:sham组小鼠脑组织神经细胞内线粒体形态呈长棒状,具有丰富的嵴结构;相较sham组,I/R组小鼠脑组织神经细胞内线粒体形态显著收缩,呈圆球状,内膜上的嵴结构明显消失或减少;相较于I/R+AAV-NC组,I/R+AAV-CISD2组小鼠脑组织中神经细胞线粒体形态趋于改善,线粒体内膜上的嵴结构明显的增多;相较于I/R+AAV-CISD2组,I/R+AAV-CISD2+ML385组小鼠脑组神经细胞内线粒体形态损伤加剧,嵴结构明显减少。5.微板法测量组织内亚铁离子、MDA和GSH的结果表明:相较于sham组,I/R组小鼠脑组织中亚铁离子和MDA水平显著升高(均p<0.01),GSH水平显著降低(p<0.01);相较于I/R+AAV-NC组,I/R+AAV-CISD2组小鼠脑组织中亚铁离子和MDA水平显著性降低(均p<0.01),GSH水平显著性增高(p<0.01);相较于I/R+AAV-CISD2组,I/R+AAV-CISD2+ML385组小鼠脑组织中亚铁离子和MDA水平显著性升高(均p<0.05),GSH水平显著降低(均p<0.01)。6.免疫印迹法检测脑组织中蛋白表达的结果表明:相较于sham组,I/R组中TFR1和N-Nrf2表达显著升高(均p<0.05),CISD2、GPX4、x CT和HO-1蛋白表达显著降低(均p<0.05);相较于I/R组,过表达CISD2后,相较于I/R+AAV-NC组,TFR1表达显著降低(p<0.05),N-Nrf2、GPX4、x CT和HO-1蛋白表达显著增高(均p<0.05);在过表达CISD2的基础上使用Nrf2抑制剂,相较于I/R+AAV-CISD2组,TFR1表达显著升高(均p<0.01),NNrf2、GPX4、x CT和HO-1蛋白表达显著降低(均p<0.01)。7.细胞存活率结果表明:相较于control组,OGD/R组细胞存活率显著降低;过表达CISD2后(p<0.001),相较于OGD/R组细胞存活率显著升高(p<0.01);而CISD2敲低组相较于OGD/R组,细胞存活率却进一步降低(p<0.01);而在过表达CISD2的基础上使用ML385,相较于CISD2过表达组细胞存活率显著降低(p<0.01)。8.胞内亚铁离子染色和Lipid ROS结果表明:相较于control组,OGD/R组胞内亚铁离子水平和Lipid ROS水平显著升高(p<0.01);相较于OGD/R组,CISD2过表达后胞内的亚铁离子水平和Lipid ROS水平显著降低(p<0.01);而在过表达CISD2的基础上使用ML385,相较于OGD/R+OE组,胞内的亚铁离子水平和Lipid ROS水平显著增高(p<0.05)。9.免疫印迹法检测细胞中蛋白的表达结果表明:相较于control组,OGD/R组中TFR1和N-Nrf2表达显著升高(均p<0.01),CISD2、GPX4、x CT和HO-1蛋白表达显著降低(均p<0.01);相较于OGD/R组,过表达CISD2后,TFR1表达显著降低(均p<0.01),N-Nrf2、GPX4、x CT和HO-1蛋白表达显著增高(均p<0.01);在过表达CISD2的基础上使用Nrf2抑制剂,相较于OGD/R+OE组,TFR1表达显著升高(均p<0.05),N-Nrf2、GPX4、x CT和HO-1蛋白表达显著降低(均p<0.05)。结论:1.上调CISD2具有减轻小鼠的脑缺血再灌注损伤的作用。2.上调CISD2抗小鼠脑缺血再灌注损伤的作用可能与其对铁死亡的抑制有关。3.上调CISD2的脑保护作用可能与其对Nrf2/HO-1通路的激活有关。