背景听力损失（Hearing Loss,HL）是最常见的致残性疾病之一,占各类残疾的33%,严重影响人类的正常认知和交流,给患者及其家庭乃至社会造成了巨大的精神和经济负担。前庭导水管扩大（Enlarged Vestibular Aqueduct,EVA）是中国感音神经性耳聋儿童中最为常见的内耳畸形,SLC26A4基因变异在中国耳聋人群中检出率居第二位,仅次于GJB2基因,SLC26A4基因变异造成的耳聋约占感音神经性耳聋的5%-19%,该基因为常染色体隐性遗传。SLC26A4基因是目前发现与前庭导水管扩大有高度的关联性的唯一基因,以往研究中高达90%的患者可以通过检测SLC26A4基因得到诊断（检出纯合或复合杂合变异）。目的本研究期望基于多重PCR扩增和二代测序技术设计开发一种快速低成本高通量SLC26A4基因检测方法,通过对EVA患者的SLC26A4基因进行全序列、多手段深入细致的分析,期望所有的患者都能够获得遗传学上的诊断,并对检测到的变异进行解读,提供准确可靠的变异致病性评级结果;同时为患者及其家属们提供遗传咨询,减少二次伤害。方法1.针对SLC26A4基因的全部外显子和侧翼区域设计多对特异性引物,经过试验确定最佳反应条件,采用多重PCR扩增技术,对目的区域进行扩增;然后连接测序接头和特异Index序列,进行文库构建;质控合格的文库行高通量测序,最后进行遗传变异分析。2.募集EVA患者家系,使用本检测方法进行基因检测,采用自主搭建的分析流程进行SNP/Indel分析,检测筛选到的变异经Sanger测序验证,并且对检测到的罕见变异根据ACMG指南进行变异解读。3.对于未诊断的（在SLC26A4基因中只检测到一个变异或未能检测到变异）EVA患者进行拷贝数变异（Copy number variation,CNV）分析,然后采用长片段扩增结合Sanger测序、第三代测序技术进行验证和断点确定。结果1.本检测方法对112个EVA家庭检测结果显示,共有95.54%（107/112）的家系在SLC26A4基因上检测到纯合或复合杂合变异获得诊断,另外5个家系未能诊断,包括4个（3.57%）携带单等位基因变异,1个（1.89%）没有检测到SLC26A4基因变异,检测结果经Sanger测序验证一致。本检测方法已经申请发明专利,目前已进入实质性审查阶段。2.从SLC26A4基因中检测出的变异中筛选了30种罕见变异,根据ACMG指南人工对这些变异进行了评级,其中26个变异评级为致病,4个变异评级为可能致病,与Clinvar数据库评级相比,20个变异评级从意义未明/可能致病/未收录变异升级为致病。3.对筛选入组的10个EVA未诊断家系进行了SLC26A4基因CNV分析,包括112家系中2个和后续研究筛选入组8个家系,在其中5个家系里检测到了CNV,其中1个家系中检测到SLC26A4基因Exons1-3的7666bp杂合缺失变异;2个家系检测到了SLC26A4基因Exons5-6的1845bp杂合缺失变异,1个家系检测到了纯合缺失变异;在1家系中检测到SLC26A4基因Exons9-10的4991bp杂合缺失变异。这三种CNV的形成机制可能是非等位基因同源重组（NAHR）和复制叉停滞或模板转换机理（Fo STe S）。结论1.本研究基于多重PCR扩增和NGS成功设计了一种检测方法来鉴定EVA患者在SLC26A4基因中的变异。该方法快速、经济,每个样本只需要少量的测序数据（10 Mbp）,最短可以36小时内完成整个实验和分析过程。本检测方法诊断率明显优于国内外同类产品。通过对比实验和Sanger测序也验证得到本检测方法的准确性为100%。2.根据ACMG指南对检测到的罕见变异进行了科学的变异解读,提高了大部分罕见变异的致病性,为患者提供了更可靠检测结果,也为其他研究者提供了依据和参考。3.通过本检测方法在5个家系中检测到了CNV,并通过了验证,CNV可能是EVA的一个重要致病原因。表明本基因检测方法不仅可以检测SNP/Indel,同时还可以检测外显子区域的CNV变异。此外,报道了两个新的变异SLC26A4:c.2162C>A和SLC26A4:Exons9-10缺失。