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力学刺激在骨代谢中发挥着举足轻重的调节作用。在人体骨骼结构及人类日常生活中,生物力学刺激对骨组织的新陈代谢起着非常重要的作用。骨量的维持依赖于机械力学刺激,同时骨量又对机械力学刺激发生适应性改建。适宜的牵张应力可以在牵张成骨、骨折修复、正畸牙齿移动等许多临床治疗中刺激骨组织自身的生长与重建,达到促进新骨形成的目的,重复增加的负荷,如定期规律地运动,也可以诱导新的骨形成,而缺乏力学刺激如长期卧床、神经肌肉麻痹或航天飞行等情况下力学负荷减少,承重骨骼中的骨质量就会丧失。在过去的几十年里,骨细胞逐渐被大家公认为是骨骼内的应力感受细胞和效应细胞,骨细胞通过将外部机械力转化为生物化学反应来协调重塑过程,这是一种称为机械转导的过程。探索成骨细胞的生物力学信号转导机制对于阐明骨改建的机理,发现调控骨生长的新靶点具有重要意义。NF-κB是参与骨代谢,调节炎症,影响先天性和适应性免疫反应的最重要的转录因子之一1,2。在骨骼形成方面,NF-κB信号直接参与破骨细胞的分化和活化3,4。慢性NF-κB激活沿着成骨途径影响间充质干细胞（mesenchym al stem cell,MSC）分化,削弱成骨细胞介导的骨形成5。众多学者的研究提示NF-κB参与机械应力刺激下细胞内的反应过程。而NF-κB的激活即RelA/p65（NF-κB亚基）向细胞核的易位需要肌动蛋白细胞骨架的动态改变;干扰肌动蛋白细胞骨架的改变会抑制RelA/p65的核聚集7。因此,肌动蛋白细胞骨架重塑可能会影响NF-κB活性并参与一系列反应。在本课题组的前期工作中对机械牵张应力加载前后的成骨细胞进行了蛋白质组学分析,其中细胞骨架调节蛋白--丝切蛋白Cofilin的表达在加载后显著增高,并明确了Cofilin在机械应力刺激中对成骨分化的积极作用6。Cofilin是一种肌动蛋白结合蛋白,通过刺激肌动蛋白丝的切断和去聚合作用,在肌动蛋白丝动力学和重组过程中发挥重要作用8,Cofilin作为影响调控细胞骨架蛋白的重要因子也同样是力学敏感蛋白,综上考虑,本研究推测成骨细胞内,Cofilin对NF-κB同样有调控作用,并设计了两部分研究内容:第一部分机械牵张应力作用下NF-κB对成骨细胞成骨效能的影响目的:探索机械牵张应力作用下,NF-κB对成骨细胞成骨效能的影响;方法:应用慢病毒转染的方法分别建立成骨细胞MG63内RelA（NF-κB的主要亚基）过表达与下调的模型,随后应用Flexcell细胞力学加载系统对不同RelA表达情况的成骨细胞MG63加载12%的静态牵张力,并设置1h、4h、8h、12h不同加力时长,同时设置不加力对照组,加力完成后收集细胞,使用酶动力学法检测不同分组细胞碱性磷酸酶表达情况,茜素红染色检测钙结节形成,Elisa法检测骨钙素与I型胶原分泌并使用实时定量RT-PCR的方法检测成骨相关重要基因Runx-2、Osterix和I型胶原的表达;结果:RelA过表达的MG63组细胞在加载机械牵张应力后,不同加力时长成骨细胞内成骨相关蛋白及基因表达有所不同,随着加力时间的延长,成骨相关ALP,骨钙素以及I型胶原的表达均出现了小幅增长,随后下降的趋势;相比于MG63组细胞,RelA过表达组的三种成骨相关蛋白增长趋势较弱,同时需要较长时间的牵张力刺激,钙结节的表达情况也明显低于MG63组。RT-PCR检测了Runx-2、Osterix和I型胶原的基因表达情况,结果与蛋白表达相关实验结果呈现相类似的变化趋势。而RelA下调MG63组的细胞,成骨相关蛋白表达显著高于正常细胞组,成骨相关基因的表达也远高于正常细胞组,同时只需要相对较短的加力时长,加力仅1h就出现成骨相关蛋白与基因表达的显著增高;结论:机械牵张应力刺激下,成骨细胞的成骨性能发生显著变化;不同时长的12%静态牵张力对成骨细胞成骨性能影响不同。NF-κB在机械牵张应力刺激下对成骨细胞的成骨性能发挥着显著的负向调控作用。本研究深入研究了机械牵张应力作用下成骨细胞内NF-κB的作用,为理解机械力学刺激下成骨细胞内的作用机制提供了一定的理论基础。第二部分机械牵张应力作用下成骨细胞内Cofilin对NF-κB的调控机制研究目的:系统探讨机械牵张应力作用下成骨细胞内Cofilin的表达和NF-κB活性之间的关系,以明确机械牵张应力能否通过上调Cofilin表达进而抑制NF-κB活性从而促进成骨;方法:应用慢病毒转染的方法分别上调和下调成骨细胞MG63内Cofilin的表达,对细胞加载12%的静态牵张力,并设置15min、30min、45min、60min不同加力时长,同时设置不加力对照组,加力完成后收集细胞,应用Western Blotting分别检测细胞全蛋白内NF-κB激活相关重要蛋白IκBα,p-IκBα,IKK和p-p65的表达和细胞核蛋白内p-p65的表达,并通过双荧光素酶报告基因的方法验证NF-κB与启动子DNA结合的能力变化,以及Cofilin对NF-κB的调节作用;结果:细胞全蛋白WB的结果显示相比于Cofilin过表达MG63组与MG63组,Cofilin下调MG63组NF-κB的抑制蛋白IκBα降低较快且更明显,同时p-p65也很快在细胞中聚集,并通过核蛋白WB的结果看到p-p65明显发生核内聚集移位,表明Cofilin下调MG63组NF-κB的激活较快发生,并且能在不同时长的加力中仍保持激活状态;双荧光素酶报告基因结果证实了Cofilin下调MG63组NF-κB与启动子DNA的结合能力较强,并需要较短时间的机械力刺激就可显著提高其活力;结论:机械牵张应力作用下,成骨细胞内NF-κB活性发生显著变化,适当时长的机械牵张应力可以有效激活NF-κB,其中加力30min时成骨细胞内NF-κB活性最高,与启动子DNA结合能力最强;机械牵张力作用下,Cofilin对NF-κB发挥着显著的负向调控作用,机械牵张应力可以通过上调Cofilin的表达抑制NF-κB的活性,继而促进成骨细胞成骨分化,证实了Cofilin可以通过抑制NF-κB的表达来促进成骨细胞的成骨性能。