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目的:探讨鞣花酸(Ellagic acid,EA)对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的多巴胺(dopamine,DA)能神经元损伤的保护作用及其可能机制。方法:1.在体实验:30只SD大鼠(200-250g)随机分为5组:假手术组、EA(50 mg/kg)组、LPS(10μg)组、LPS+EA(10 mg/kg)组和LPS+EA(50 mg/kg)组,每组6只。采用单侧中脑黑质内注射LPS(10μg)诱导DA能神经元损伤模型。制模后连续7天灌胃给予EA。通过转棒实验分析大鼠行为学改变;免疫组织化学染色检测DA能神经元特征性标记物—酪氨酸羟化酶(TH)的表达;免疫荧光双标法观察小胶质细胞特征性标志物—离子钙结合蛋白1(Iba-1)和NLRP3炎症小体的共定位现象;Western Blot检测TH、Iba-1、NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1、TNF-α,IL-1β和IL-18的蛋白表达。2.离体实验:(1)为了观察EA对DA能神经元有无直接保护作用,将MN9D细胞(DA能神经元细胞株)随机分为5组:空白组、EA(1μM)组、6-OHDA(100μM)组、6-OHDA+EA(0.1μM)组、6-OHDA+EA(1μM)组。细胞给予EA预处理30 min后加入6-OHDA处理24 h,通过MTT法检测细胞存活情况;免疫细胞化学染色法和Western Blot检测TH蛋白变化。(2)进一步采用BV-2细胞(小胶质细胞株)观察EA对LPS诱导的小胶质细胞激活的影响。细胞随机分为5组:空白组,EA(1μM)组,LPS(100 ng/ml)组,LPS+EA(0.1μM)组,LPS+EA(1μM)组。EA预处理30 min后,再给予LPS处理24 h。免疫细胞化学染色法检测小胶质细胞激活情况;Western Blot检测Iba-1、NLRP3、pro-caspase-1和caspase-1蛋白变化;ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中炎症因子(TNF-α,IL-1β和IL-18)的水平。(3)为了确定EA抗神经炎症是否依赖于小胶质细胞NLRP3炎症小体,本研究采用BV-2细胞,选择性地沉默NLRP3,实验分为8个组:空白组,EA(1μM)组,LPS(100 ng/ml)组,LPS+EA组,NLRP3 siRNA空白组,NLRP3 siRNA+EA组,LPS+NLRP3 siRNA组,LPS+EA+NLRP3 siRNA组。Western Blot检测NLRP3沉默效率及Iba-1、NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1的蛋白变化,ELISA试剂盒检测细胞培养液TNF-α,IL-1β和IL-18的水平。此外,在上述分组中,经EA和LPS作用细胞24 h后,将BV-2细胞上清转移至MN9D细胞中,继续培养24 h,通过Western Blot实验观察NLRP3炎症小体在EA产生神经保护作用中的作用。结果:1、在体实验结果:在行为学实验中,LPS组大鼠的在棒时间比假手术组少,给予EA(50 mg/kg)后,大鼠在棒时间明显增加;根据免疫组织化学染色和western blot实验显示,LPS组DA能神经元数量减少,给予EA(50 mg/kg)处理后DA能神经元损伤减轻;免疫荧光染色和Western Blot结果显示,与LPS组相比,给予EA(50 mg/kg)后,小胶质细胞激活以及NLRP3炎症小体表达明显下降。2、离体实验:(1)在MN9D细胞中,与空白组比较,6-OHDA导致MN9D细胞损伤,给予EA(1μM)治疗后,损伤没有减轻,提示EA并不能对DA神经元直接产生保护作用。(2)在BV-2细胞中,与空白组比较,LPS组小胶质细胞明显激活,Iba-1和NLRP3炎症小体蛋白表达升高,炎症因子(TNF-α,IL-1β和IL-18)释放增加;而给予EA(1μM)后,小胶质细胞激活减轻,Iba-1和NLRP3炎症小体表达下降,炎症因子释放明显减少。(3)选择性地沉默小胶质细胞中NLRP3后,Western Blot和ELISA结果显示,EA对小胶质细胞激活以及释放的炎症因子的抑制作用消失。另外,将BV-2细胞上清转移至MN9D细胞后,经过LPS处理的BV-2细胞培养液对MN9D细胞造成损伤,TH蛋白表达下降;给予EA(1μM)处理后,MN9D细胞的TH蛋白表达增加;选择性地沉默小胶质细胞中NLRP3后再给予EA处理,EA神经保护作用消失。结论:EA对LPS诱导的DA能神经元损伤具有保护作用,其机制可能与抑制小胶质细胞NLRP3炎症小体的激活有关。