目的：　　本实验主要探讨丹皮酚是否能增强表柔比星的抗乳腺癌活性及其具体的作用机制，是否能减轻表柔比星诱导的心脏、肝脏和肾脏毒性及其具体作用机制。　　方法：　　1.丹皮酚增强表柔比星体外抗乳腺癌活性的研究　　选用小鼠乳腺癌细胞株4T1及人乳腺癌细胞株MCF-7，MTT法检测不同浓度的丹皮酚或/和表柔比星对乳腺癌细胞增殖的抑制作用，计算出联合用药指数，评价联合用药效果。AnnexinⅤ-FITC/PI双染法、Hochest33258检测丹皮酚或/和表柔比星对乳腺癌细胞凋亡的影响。Western blotting法检测丹皮酚或/和表柔比星对凋亡蛋白cleaved PARP，cleaved caspase-3，Bax和Bcl-2表达的影响。最后检测p38/ERK/JNK MAPKs通路中主要蛋白的表达，探讨丹皮酚或/和表柔比星抑制乳腺癌细胞增殖可能介导的信号转导通路。　　2.丹皮酚增强表柔比星体内抗乳腺癌活性的研究　　选Balb/c小鼠第四对右侧乳腺注射4T1癌细胞，建立小鼠原位乳腺癌模型。待肿瘤长到约100 mm3时，给予丹皮酚(200 mg/kg)灌胃或/和表柔比星(2.5 mg/kg)尾静脉注射，两天一次，共八次。每次给药后测量肿瘤长和宽，计算肿瘤体积。最后一次给药后，取肿瘤称重，计算药物的抑瘤率及联合用药指数。取肿瘤组织做免疫组化检测微血管生成，TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡，Western blotting法检测丹皮酚或/和表柔比星对凋亡蛋白cleaved PARP，cleaved caspase-3，Bax和Bcl-2表达的影响。最后检测p38/ERK/JNK MAPKs通路中主要蛋白的表达，探讨丹皮酚或/和表柔比星抑制乳腺肿瘤生长可能介导的信号转导通路。　　3.丹皮酚降低表柔比星诱导的小鼠心脏毒性的研究　　建立Balb/c小鼠4T1原位乳腺癌模型。待肿瘤长到约100 mm3时，给予丹皮酚(200 mg/kg)灌胃或/和表柔比星(2.5 mg/kg)尾静脉注射，两天一次，共八次。每次给药后，称量记录小鼠体重。最后一次给药后，取血浆及心脏组织称重，计算体重以及心脏重量/体重的比值。检测血浆中LDH、AST、CK和CK-MB的表达，心肌组织中SOD、MDA、GSH和CAT的活性及含量，HE染色观察心肌组织病理学变化，TUNEL染色检测心肌细胞凋亡，qRT-PCR检测炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的变化，Western blotting法检测丹皮酚或/和表柔比星对凋亡蛋白cleaved PARP，cleaved caspase-3，Bax和Bcl-2表达的影响。最后检测NF-κB通路中主要蛋白的表达，探讨丹皮酚降低表柔比星诱导的心脏毒性可能介导的信号转导通路。　　4.丹皮酚降低表柔比星诱导的小鼠肝脏毒性的研究　　体外选用原代肝细胞，MTT法检测不同浓度的丹皮酚或/和表柔比星对其增殖的抑制作用，评价表柔比星的毒性作用及丹皮酚降低表柔比星的毒性作用。建立Balb/c小鼠4T1原位乳腺癌模型。待肿瘤长到大约100 mm3时，给予丹皮酚(20mg/kg)灌胃3天，每天一次，和/或第四天的表柔比星(9 mg/kg)尾静脉注射。最后一次给药后，称体重，取血浆及肝脏组织称重，计算体重以及肝脏重量/体重的比值。检测血浆中ALT、AST、ALP和GGT的表达，肝脏组织中SOD、MDA、GSH和CAT的活性及含量，HE染色观察肝脏组织病理学变化，TUNEL染色检测肝脏细胞凋亡，qRT-PCR检测炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的变化，Western blotting检测丹皮酚或/和表柔比星对凋亡蛋白cleaved PARP、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2及cytochrome c表达的影响。最后检测PI3K/Akt/NF-κB通路中主要蛋白的表达，探讨丹皮酚降低表柔比星诱导的肝脏毒性可能介导的信号转导通路。　　结果：　　1.丹皮酚增强表柔比星体外抗乳腺癌活性　　MTT结果显示，表柔比星对4T1和MCF-7乳腺癌细胞具有剂量依赖性抑制作用，IC50值分别为2.05μM和1.98μM，CDI分别为0.59到0.82，0.63到0.84，均小于1，表明丹皮酚能增强表柔比星抗乳腺癌细胞增殖的活性。丹皮酚(0.2 mM)和/或表柔比星（4μM）孵育4T1细胞48 h，Hoechst33258染色显示，表柔比星组、联合用药组出现明显的细胞凋亡特征，包括细胞核固缩、细胞膜完整性缺失或呈现核分裂。流式结果显示，与对照组相比，表柔比星和联合用药组细胞凋亡率明显增多，分别为37.7％和51.5％。Western blotting结果显示，相对于对照组，表柔比星显著增加凋亡蛋白cleaved PARP，cleaved caspase-3和Bax的表达，降低Bcl-2的表达。在对照组、表柔比星组和联合用药组，p-p38、p-JNK和p-ERK的表达依次降低，并具有统计学意义，而总的p38、JNK和ERK表达并无明显变化。　　2.丹皮酚增强表柔比星体内抗乳腺癌活性　　对照组、丹皮酚组、表柔比星组及联合用药组的小鼠肿瘤体积分别823.93mm3、709.1 mm3、284.16mm3和160.34 mm3。丹皮酚组、表柔比星组及联合用药组的抑瘤率分别为9.15％、65.04％和73.63％。两药联用的理论联合效应为0.6171，小于实际联合效应0.7363，表明丹皮酚与表柔比星具有协同抗肿瘤作用。免疫组化结果显示表柔比星组相对于对照组，VEGF和CD31的表达减少，而联合用药组两者表达更少。TUNEL染色结果显示丹皮酚、表柔比星及联合用药的细胞凋亡率分别为24.67％、59.83％和76.67％。表柔比星显著增加凋亡蛋白cleaved PARP，cleaved caspase-3和Bax的表达，降低Bcl-2的表达。在对照组、表柔比星组和联合用药组，p-p38、p-JNK和p-ERK的表达依次降低，并具有统计学意义，而总的p38、JNK和ERK表达并无明显变化。　　3.丹皮酚降低表柔比星诱导的小鼠心脏毒性　　与对照组、丹皮酚组相比，表柔比星组的小鼠体重明显减轻，绝对和相对心脏重量明显的增加。表柔比星给药后，血浆中LDH、AST、CK和CK-MB的水平明显增加，心脏组织中SOD、MDA、GSH和CAT的活性及含量、炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平，与对照组都有显著的变化。HE染色呈现出严重的心脏损伤，包括胞质空泡的形成、心肌纤维肿胀和间质出血。TUNEL染色表现出明显的心肌细胞的凋亡。在联合用药组，以上变化都有所改善。Westernblotting结果显示，表柔比星组与对照组相比较，显著增加了心肌组织中凋亡蛋白cleaved PARP，cleaved caspase-3和Bax的表达，降低Bcl-2的表达。增加P-NF-κB的表达，降低IκBα的表达。联合用药组则抑制了凋亡蛋白的表达和NF-κB通路的活性。　　4.丹皮酚降低表柔比星诱导的小鼠肝脏毒性　　MTT结果显示表柔比星对原代肝细胞具有的毒性作用，而丹皮酚能降低表柔比星诱导的毒性作用。对照组和丹皮酚组的小鼠体重、肝脏体重、肝脏/体重比值并无差异。表柔比星组的小鼠体重有明显减轻、绝对和相对肝脏重量则有明显的增加。而联合用药组与前者相比，呈相反的趋势。表柔比星给药后血浆中ALT、AST、ALP和GGT的表达，肝脏组织中SOD、MDA、GSH和CAT的活性及含量、炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平，与对照组都有显著的变化。HE染色呈现出严重的肝脏损伤，包括肝细胞坏死、炎性细胞浸润和间质出血。表柔比星给药后，TUNEL染色也表现出明显的肝脏细胞凋亡。Westem blotting结果显示，表柔比星组与对照组相比较，显著增加了肝脏组织中凋亡蛋白cleavedPARP，cleaved caspase-3、cytochrome c和Bax的表达，降低Bcl-2的表达，增强PI3K/Akt/NF-κB主要蛋白的表达。相对于表柔比星组，联合用药组的肝损伤有明显地改善，凋亡蛋白的表达及PI3K/Akt/NF-κB通路的活性有明显的抑制。　　结论：　　1.丹皮酚能增强表柔比星体外、体内的抗乳腺癌细胞增殖的活性，其增效作用与抑制乳腺癌细胞中p38/JNK/ERK MAPK信号通路有关。　　2.丹皮酚能降低表柔比星诱导的心脏毒性，其保护作用与抑制心脏组织中NF-κB信号通路有关。　　3.丹皮酚能降低表柔比星诱导的肝脏毒性，其保护作用与抑制肝脏组织中PI3K/Akt/NF-κB信号通路有关。　　4.丹皮酚能降低表柔比星诱导的肾脏毒性，其保护作用与抑制肝脏组织中NF-κB信号通路、激活Nrf2/HO-1信号通路有关。