青稞又称裸大麦，属于禾本科一年或多年生植物—大麦(Hordeum vulgare)的一类，因其颖果与稃分离而得名。我国是大麦的起源地之一，种质资源丰富，尤其是裸粒类型占有特别突出的地位。近年来，由于裸大麦品种富含重要生理活性物质β-葡聚糖而倍受关注，国际上已经把它列为新一代优秀的功能性食品，制定并推行以β-葡聚糖为主的裸大麦开发计划；β-1，3-葡聚糖酶(β-1，3-D-葡聚糖-3-葡萄糖苷水解酶，EC3.2.1.39)蛋白家族几十年来一直受到极大关注，对它的研究已涉及到分类、生理、抗病、分子生物学、基因工程等方面。 本文对青稞资源的研究概况进行了概述，采用酶法，对来源于西藏、甘肃、云南和四川等地的34个青稞育成品种及农家品种进行了种子β-葡聚糖含量的测定，测定指标包括可溶性β-葡聚糖含量和总β-葡聚糖含量。测定结果表明34个受试品种的β-葡聚糖总量变化在3.87％-11.96％之间，其中23个品种的β-葡聚糖总量超过5％，约占67.6％。品种中可溶性β-葡聚糖含量超过不溶性β-葡聚糖含量(个别例外)。 研究以热水提取+酶法分离纯化青稞种子中的β-葡聚糖，得率约为5％，探索了一种高效简便的β-葡聚糖提取方法以适应生产的需要。对所获多糖进行了相关的性质分析：纸层析结果显示为单一条带，紫外吸收光谱表明无蛋白质及核酸污染，红外光谱结果表明该多糖为典型的β-吡喃糖构型，扫描电镜对其形态作了观测，形貌近似于圆球的颗粒状，且十分均匀。 利用RAPD技术对西藏高原青稞21个育成品种和2个农家品种进行了遗传四川大学博士学位论文多样性分析，从68个随机引物中筛选出5个可扩增出稳定重复图谱的有效引物，共扩增出48条带，多态性比例达92%。利用RAPDistsLnce 1 .04，计算出遗传距离，通过聚类分析得到了这23个青裸品种的遗传关系，根据RAPD结果将这23个品种分为2大类，构建了分子系统树。并利用引物S犯和518扩增的19条多态性带建立了品种鉴定的分子指纹图谱。 依据GenBallk中p一1，3一葡聚糖酶基因的保守序列设计简并引物，通过反转录聚合酶链式反应和快速分离cDNA末端技术扩增得到青棵p一1，3一葡聚糖酶n (HBGHZ)基因全长cDNA(GenBal水注册号AFS 15785)。该cDNA全长由12巧个碱基组成，包含一个完整的编码334个氨基酸的开放阅读框(ORF)，构成一个35kDa的前体蛋白，成熟蛋白由306个氨基酸组成，前28个氨基酸为信号肤，在起始密码子上游有一个由46个碱基组成的5’非编码区;在终止密码子下游有一个由165个碱基组成的3’非编码区，包括1个加poly(A)信号和一个长度为19个腺昔酸的Poly(A)尾。经Blast发现，推测的多肤序列与已发表的大麦p一1，3一葡聚糖酶n基因具有99%的同源性。根据得到的p一1，3一葡聚糖酶n基因的cDNA序列设计引物，采用基因组步查技术克隆了青棵基因组中的一个2135bPDNA片段(GenBar水注册号AY178838)。序列分析结果表明，该基因也包含了同上的开放阅读框，在5’端，除具有46个核昔酸外，还包含一个773核昔酸的5’上游序列，含有推测的2个TATA盒，4个CAAT盒和4个GC盒，该基因的编码区内具有大麦p一1，3一葡聚糖酶n基因的基因特征:信号肤与成熟蛋白之间有内含子，长165bP。southem杂交显示多条带，RT一PCR和Northem杂交只在发芽6天和9天的苗中检测到信号。由此可认为该青棵p一1，3一葡聚糖酶n基因在结构上与大麦p一1，3一葡聚糖酶H基因是同源的，是p一1，3一葡聚糖酶基因家族中的一个新成员。此基因的克隆，为深入研究p一1，3一葡聚糖酶n基因结构，表达和调节机制及其结构和功能的关系奠定了重要的基础。 用PCR方法扩增完整青棵p一1，3一葡聚糖酶n(HBGHZ)和成熟蛋白(不含信号肤)编码区，定向克隆到表达载体pQE一30上，获得重组质粒pQE一1和pQE一2。经IPTG诱导，编码完整蛋白酶的pQE一1未在E.coliM巧中表达，而编码成熟蛋白的pQE一2表达出了N端融合了6 x His的融合蛋白，其表达量占菌体总蛋白的12.4%。SDS一PAGE分析表明，表达产物的分子量约为33kD。用Ni一Nl’A亲和树脂分离纯化融合蛋白，纯度可达90%以上。表达产物在体外酶活四川大学博士学位论文实验中表现出典型的B一1，3一葡聚糖酶切伍C3.2.1.39)活性(18oonkat)。体外抗真菌活性实验表明，HBGHZ处理48hr后，使小麦赤霉病菌、玉米弯抱菌、松赤枯菌、胶抱炭疽菌和玉米纹枯菌的生长受到不同程度的抑制，共同的趋势为，随着蛋白质浓度的增加，抑菌效率也相应提高。其中对小麦赤霉病菌、玉米弯抱菌、松赤枯菌、胶胞炭疽菌的抑菌效果较为明显。 利用PCR技术克隆了青棵HBGE口基因632bP和“7bP的正义片段和反义片段，经酶切图谱分析和序列分析鉴定后，插入到植物表达载体pFGC5941中，构建了含HBGHZ基因正义和反义片段基因质粒载体，用农杆菌侵染拟南芥植株花蕾，在含有Basta和卡那霉素的MS培养基上选择转化子和植株再生，对转化植株不同发育时期不同器官进行切片观察，发现表达了反义片段的植株其根茎叶花微结构与正常植株相比有较明显差异，由此可以推测HBGHZ基?