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单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes，单增李斯特菌)是一种重要的食源性病原菌，能引起李斯特菌病，表现为胃肠炎、败血症、髓膜炎、脑炎等。该病在孕妇、老人及免疫力低下人群中多发，虽发病率不高，但死亡率高达30％。单增李斯特菌为革兰氏阳性短杆菌，在自然环境中广泛存在；当其进入宿主体内后，能迅速完成角色转换，成为胞内寄生菌。该菌在宿主体内的增殖、扩散都在细胞质中完成，而建立感染的前提是菌体在膜裂解因子的作用下逃离吞噬小体。本文旨在研究主要膜裂解因子李斯特菌溶血素(LLO，由hly编码)与广谱磷脂酶C(PC-PLC，由plcB编码)在分离自消毒奶的弱毒株M7中的表达调控状况，及其对M7菌株致病力的影响。
通过点突变技术构建了两株针对plcB5’UTR区域及ORF第1位的突变株，发现其溶脂活性均消失，plcB基因在M7-plcB-m1和M7-plcB-m2中的转录水平分别是亲本株M7的13.8％和27.6％，表明PC-PLC对菌株M7强溶脂活性具有重要作用，且其编码基因5’UTR区域也对该表型有影响。利用Tn917筛选出两株溶脂活性消失的转座突变体，转座子插入位点分别在prfA ORF内和P1启动子中。这两株插入突变体的主要毒力基因(包括plcB、hly等)转录水平均低于亲本株(P<0.05或P<0.01)，表明PrfA对主要毒力因子发挥重要调控作用。
利用同源重组技术构建hly与plcB单缺失与双缺失突变株。乳酸脱氢酶(LDH)试验表明，在相同MOI条件下，M7及plcB单缺失株对Caco-2细胞毒性达86.8％和83.2％，hly单缺失株与hly-plcB基因双缺失株的细胞毒性仅为23.5％和11.1％。由此可见，LLO(hly)对Caco-2细胞毒性作用具有决定性作用。但双缺失株对小鼠毒力(LD50>107.95)与亲本株(LD50=107.46)相似。表明LLO介导细胞毒性且与致病性有关，但是其强溶血性和细胞毒性并非M7菌株弱毒的机制。
通过对M7和强毒株EGD中PrfA氨基酸序列分析，发现3个差异位点，分别为145、165与197位。据此构建两株以EGD prfA替换M7相应ORF的突变株，其中一株仍保留亲本株PrfA第197位的氨基酸。这两株突变株的体外溶脂活性均消失，溶血活性显著低于亲本株(P<0.01)，表明了PrfA对PC-PLC和LLO的调控作用。虽然两株突变株(M7-EGDprfA-1和M7-EGDprfA-2)的毒力因子转录水平均显著低于M7(P<0.01)而与EGD相仿(P>0.05)，但其对小鼠的毒力(LD50为105.12和104.64)仍低于EGD(LD50为101.99)。表明除PrfA、LLO和PC-PLC外，M7菌株中可能还存在其它因子与其弱毒有关。
本研究为进一步探明膜裂解因子LLO和PC-PLC在弱毒株M7中的表达、调控及其对细菌致病力的影响提供了许多有用的突变体，并做了大量前期工作：(1)M7菌株plcB的5’-UTR区域影响其PC-PLC的表达，从而影响该菌株体外强溶脂活性表型；(2)LLO在M7菌株对细胞的毒性中起重要作用；(3)PrfA是单增李斯特菌的必需毒力因子，包括LLO与PC-PLC在内的多个毒力因子受其调控，而在M7菌株中存在的PrfA差异氨基酸对其弱毒起重要作用。本研究对后续深入研究具有重要意义。