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背景与目的目前,阴沟肠杆菌复合体(Enterobacter cloacae complex,ECC)所包含阴沟肠杆菌、霍氏肠杆菌等多个菌种及亚种在自然界中广泛存在、传播。作为临床上重要的条件致病菌,此菌群可引起多种局部性或全身性感染,包括血液、呼吸道、尿道、皮肤和软组织、胆道和中枢神经系统等,也是静脉导管致临床感染常见的病原菌。多数ECC菌株遗传背景复杂,具有较强的适应能力,在多种代谢环境下均可以定植生存,故相对而言,临床上预防及控制此类细菌感染、蔓延要难于其它致病菌。当前,由于抗菌药物的选择压力、临床上侵入性操作的广泛使用、以及患者自身存在严重的基础病等原因,导致产超广谱β-内酰胺酶(Extended spectrum-β-lactamases,ESBL)的菌株,乃至耐碳青霉烯类抗菌药物的ECC(Carbapenem-resistant Enterobacter cloacae complex,CREC)菌株在全球范围内检出率逐步升高。自1998年至2013年,来自世界各地的多项研究都显示ECC中ESBL携带率较高(36%-66.7%)。在国内,中国细菌耐药监测网CHINET研究报告表明,2007年度阴沟肠杆菌的碳青霉烯类耐药率<1.0%,而在2017年,阴沟肠杆菌对亚胺培南、美洛培南和厄他培南的耐药率迅速上升为6.9%、7.0%和8.2%。鉴于CREC菌株多为多重耐药,甚至泛耐药、全耐药,其所致感染医疗费用显著增加、住院时间显著延长,患者死亡率显著提高,故此类菌株的产生与流行,对于公共卫生安全造成一定的威胁。至今,针对ECC菌株,国内外已有大量的研究。但自然突变以及人类的外在干预措施,均会导致菌株适应性变异,不断形成新的耐药基因。且耐药基因可通过多种可移动元件,如质粒、插入序列(Insertion sequence,IS)、转座子等,通过接合、转化等方式,在细菌之间传播。此外肠道中定植菌株和导致血流感染ECC菌株之间是否存在一定关系尚属未知。基于此,明确ECC菌株的传播来源与途径,深入探究菌株耐药机制及致病性已成为当前临床微生物领域的研究热点之一。当今生物信息学以及高通量测序的快速发展,使得深入研究ECC菌株的流行病学和基因组学特征、耐药及传播机制成为可能。我们收集80株非重复的不同来源的ECC菌株,通过药敏实验了解所有菌株的耐药表型;利用PCR、S1-PFGE及southern印迹杂交实验了解耐药基因的分布并对其进行定位,初步了解质粒在ECC菌株的耐药基因转移的具体情况;通过二代全基因组测序,获取细菌基因组数据,明确鉴定菌种并分析其流行病学特征、耐药基因及毒力基因的携带情况;通过RAST及Easyfig构建耐药基因的周围基因环境:并基于单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)构建ECC菌株的系统发育树,分析菌株之间的亲缘关系及进化情况,最终为临床治疗与防控院内ECC所致感染提供实验室依据。方法1.采用含2 μg/ml头孢噻肟的Mac选择培养基筛选、分离纯化培养ECC菌株,采用质谱分析技术完成菌株鉴定。2.采用微量肉汤稀释法和琼脂稀释法进行体外抗菌药物的敏感实验,明确菌株耐药表型。3.采用PCR与一代测序技术进行常见的ESBL及碳青霉烯类耐药基因的筛查与鉴定,并通过S1-PFGE及southern印迹杂交实验完成耐药基因的定位。4.采用二代高通量测序技术对所有菌株进行全基因组测序;通过平均核苷酸一致性(Average Nucleotide Identity,ANI)对所有菌株进行菌种鉴定;采用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)的数据库检测分离菌株的ST分型,了解菌株ST型别分布状况;通过RAST软件对已定位于质粒上的耐药基因所在contig序列进行注释,采用Easyfig软件构建基因环境图,了解并分析耐药基因周围的基因环境;利用CARD、VFDB、ResFinder等生物信息学软件进行耐药基因、毒力基因的分析;采用TreeBeST的PHYML(最大似然法)算法基于全基因组的SNP构建系统发育树,分析菌株之间的亲缘及进化关系。结果1.自2558份多种来源的样本中筛选出80株ECC,经ANI鉴定得知,共包括69 株五.hormaechei、5 株E.cloacae、2 株 E.roggenkampii、2 株 E.ludwigii 和 2株E.asburiae。2.药敏结果显示所有菌株对阿莫西林/克拉维酸(2.47%)、头孢噻肟(4.94%)、头孢他啶(32.10%)、氨曲南(43.21%)和头孢匹罗(48.15%)的敏感率较低,多重耐药甚至泛耐药的菌株携带有多种耐药基因,包括β内酰胺类、碳青霉烯类、大环内酯类、喹诺酮、氨基糖苷类、四环素类、磺胺类、利福平、甲氧苄啶和酰胺醇类,与其药敏结果基本一致。3.PCR与一代测序结果显示共有30株ECC菌株携带blaCTX-M基因,其中包括1 5 株携带blaCTX-M-9,6 株携带blaCTX-M-15,4 株携带blaCTX-M-3,4 株携带blaCTX-M-14,1株携带blaCTX-M-55,1株携带blaCTX-M-64。另外检出7株ECC菌株携带blaNDM-1基因。4.MLST结果显示:所有菌株共检出46种ST型,最常见的是ST78(n=8),接下来依次是ST116(n=5)、ST50(n=3)、ST97(n=2)等较为多见。其中有7个ST型为本研究新发现,分别是ST1344至ST1350。携带有blaCTX-M基因的菌株最常见的也是ST78(n=6),ST51、ST93和ST116也较为多见,其余ST型均只有1个。7株携带有blaNDM-1基因的ECC菌株的ST型均不一致。5.16株分离株的blaCTX-M基因位于大小范围在～50kb至～310kb之间的质粒上,包括11株携带blacTX-M-9、2株携带blaCTX-M-3,2株携带blacTX-M-14和1株携带blaCTX-M-64,blaCTX-M-9基因周围的基因环境类型有8种,IS3000-blaCTX-M-9存在于9株blaCTX-M-9基因的分离株中。6.blaNDM-1基因有6株位于大小在40kb以下的质粒上,其周围基因环境均不相同,blaNDM-1-ble-trpF-dsbD这段序列存在于除SKLX53287之外的所有菌株中。7.系统发育树显示分离于体检人群和腹泻患者粪便的ECC菌株与导致血流感染的菌株之间并没有发生明显的聚类,并且两者之间存在多对菌株位于同一分枝上,例如 SKLX60492 和 S18082100082、SKLX58289 和 S10060403-3,同源性较高。8.所有菌株均存在大量的毒力基因,ⅡpA、sodB、bioB、hemL、hemE等几乎存在于所有的菌株中,而htpB、neuB2、lpxD等毒力基因仅存在于部分菌株中。结论1.本研究分离菌ST型具有高度的多样性,高克隆风险ST78的克隆传播是促进本院CTX-M基因传播的重要因素之一;blaCTX-M-9的基因环境多样,存在多种基因元件参与转移。2.blaNDM-1基因环境同样多样化,保守结构blaNDM-1-ble-trpF-dsbD存在于大部分菌株中。3.导致血流感染的ECC菌株可来自肠道定植菌。