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目的：胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤，其中恶性胶质瘤占有半数以上。近几十年来，即便在胶质瘤显微外科手术、放疗以及替莫唑胺药物治疗技术上已经取得了巨大进步，但患者确诊GBM后即便经过积极的手术、放疗、化疗后其5年生存率仍然低于5％。强大的迁移侵袭能力是恶性胶质瘤不良预后的重要生物学基础。由金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)所介导的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的重构是是肿瘤转移过程的关键事件，其中MMP7与MMP9则在恶性胶质瘤的迁移侵袭活动中发挥重要作用。能否有效遏制恶性胶质瘤的迁移侵袭活动直接关系到恶性胶质瘤治疗的成败。青蒿素(Artemisinin)是中国学者于上个世纪70年代从热带植物黄花蒿(Artemisia annual)中提炼出的高效抗疟疾药物。双氢青蒿素是一种青蒿类化合物的衍生物，也是青蒿类药物在体内转化后发挥药理作用的有效成分。目前青蒿素类药物抗癌方面的药理作用逐渐受到关注，其抗肿瘤机制可以分为ROS依赖的传统的细胞毒性作用以及非ROS依赖的、由信号通路相关受体所介导的机制。通过上述机制影响肿瘤细胞生长、凋亡、DNA损伤与修复免疫炎症等诸多生物学行为。ROS能够造成DNA的双链断裂损伤，并激活由p53所介导的DNA损伤后修复活动但目前就DHA抑制胶质瘤细胞迁移侵袭活动的详细分子机制还有待深入研究。异常激活的Wnt/β-catenin信号在恶性胶质瘤的增殖、凋亡与侵袭等生物学行为中起到关键作用。β-catenin在细胞内的含量主要受到β-catenin蛋白转运入核和其在胞浆内的泛素依赖性降解这两大过程的调控。过度累积的β-catenin会转运至细胞核中，调节包括细胞增殖、分化以及凋亡等多种基因的表达。目前，β-catenin的入核转录过程可以分为Wnt依赖性途径和非Wnt依赖性途径。在经典的wnt依赖性途径中，wnt蛋白与细胞膜表面的Frizzled受体结合后，下调了磷酸化的β-catenin(S45)的表达，从而抑制了β-catenin的泛素依赖性降解。β-catenin的泛素依赖性降解过程由由酪蛋白激酶1(Casein kinase Iα，CKIα)和糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase3β，GSK3β)所调控。在非Wnt依赖性途径中，激活EGFR信号通路能够通过诱导胶质瘤细胞中的丙酮酸激酶M2(PKM2)入核，磷酸化β-catenin(Y333)，进而诱导β-catenin入核并上调β-catenin下游癌基因的表达。可见，在β-catenin信号通路中，多样的磷酸化修饰是整个信号通路调节的关键。本研究旨在明确双氢青蒿素的抗胶质瘤细胞作用是否通过影响ROS活性，进一步影响P53活性，是否通过经典的wnt依赖性和/或非Wnt依赖性途径调节β-catenin，以及β-catenin对MMP7/9的调节作用，进而调控胶质瘤细胞的迁移侵袭力。 方法：⑴细胞培养；⑵细胞增殖能力检测；⑶体外Transwell迁移、侵袭实验；⑷细胞内活性氧的检测；⑸质粒构建与细胞转染；⑹Western Blot实验；⑺明胶酶谱实验；⑻免疫荧光技术；⑼染色质免疫共沉淀实验；⑽双萤光素梅报告基因；⑾裸鼠皮下移植瘤实验检测各个处理因素对U87与U251细胞体内成瘤能力的影响。 结果：①在U87与U251细胞中，与Control组相比，100、200、400μmol/L DHA作用24h后，以剂量依赖性的方式抑制U87与U251细胞的增殖、迁移和侵袭能力。DHA作用U87、U251细胞的IC50分别为210.77±18.2μmol/L和200.35±18.2μmol/L。动物实验中，DHA作用24h后，以剂量依赖性的方式抑制U87与U251细胞的成瘤能力。②Western Blot和明胶酶谱法检测结果证实，在U87与U251细胞中，与Control组相比，100、200和400μmol/L DHA以剂量依赖性的抑制MMP9和MMP7的表达与活性。③使用100、200、400μmol/L DHA处理U87细胞24h后，U87与U251细胞内的ROS含量呈剂量依赖性升高，均显著高于Control组ROS含量。Western Blot结果证实，同剂量的DHA处理24h后，U87与U251细胞中p-p53(S15)和p53的蛋白表达显著上调。④100、200、400μmol/L DHA作用24小时后，与Control组相比，U87细胞的EGFR，p-β-catenin(Y333)和β-catenin的表达水平分别显著下调;p-β-catenin(S45)的表达显著上调。与Control组相比，EGFR抑制剂预处理显著上调U87细胞p-β-catenin(S45)的表达，下调p-β-catenin(Y333)和β-catenin的表达。在U251细胞中，与Control组相比，DHA分别上调EGFR、p-β-catenin(Y333)和p-β-catenin(S45)的表达，而β-catenin表达无明显变化。与Control组相比，EGFR抑制剂预处理显著升高p-β-catenin(S45)的表达，显著下调β-catenin的表达，而p-β-catenin(Y333)的表达没有统计学意义的变化。在U87细胞中，p-β-catenin(Y333)与β-catenin在细胞核中高表达，而p-β-catenin(S45)主要在细胞浆中表达。DHA处理后，细胞皱缩明显，核偏位。与Control组相比，DHA使细胞核中的p-β-catenin(Y333)与β-catenin荧光强度下降，胞浆中p-β-catenin(S45)的荧光强度增加。在U251细胞中，β-catenin在核中高表达，而p-β-catenin(Y333)与p-β-catenin(S45)均主要在胞浆中表达。200μmol/L DHA使p-β-catenin(Y333)在细胞核中荧光强度升高，p-β-catenin(S45)在胞浆中荧光强度增加。而β-catenin在细胞核中的荧光强度未见明显变化。上述p-β-catenin(Y333)、p-β-catenin(S45)与β-catenin在U87与U251细胞中的荧光强度变化与Western Blot的结果相一致。⑤对U87细胞稳定转染突变型P53(p53-Mut)。与Control组相比，200μmol/L DHA显著降低了β-catenin、p-β-catenin(Y333)、p-β-catenin(Y333)/β-catenin、MMP9和MMP7的表达，显著降低了MMP9和MMP7的活性;DHA显著升高了p-β-catenin(S45)、p-β-catenin(S45)/β-catenin的表达。DHA组与DHA+NC组间，上述所有指标均无统计学意义的变化。与DHA+NC组相比，DHA+p53-Mut组的β-catenin、p-β-catenin(Y333)、p-β-catenin(Y333)/β-catenin、p-β-catenin(S45)、p-β-catenin(S45)/β-catenin、MMP9和MMP7的表达均显著升高(P＜0.05），同时MMP9和MMP7的活性也显著升高(P＜0.05)。对U251细胞稳定转染野生型P53(p53-WT)。与Control组相比，DHA组未改变β-catenin的表达，但DHA显著升高了p-β-catenin(Y333)、p-β-catenin(Y333)/β-catenin、p-β-catenin(S45)、p-β-catenin(S45)/β-catenin、MMP9和MMP7的表达（P＜0.05），显著降低了MMP9和MMP7的表达和活性。DHA组与DHA+NC组间，上述所有指标均无统计学意义的变化。与DHA+NC组相比，DHA+p53-WT组的β-catenin、p-β-catenin(Y333)、p-β-catenin(Y333)/β-catenin、MMP9和MMP7的表达均显著降低(P＜0.05），MMP9和MMP7的活性也显著降低（P＜0.05），但p-β-catenin(S45)的表达和p-β-catenin(S45)/β-catenin显著升高(P＜0.05)。⑥转染shβ-catenin后，与Control组相比，DHA显著抑制了U87和U251细胞的迁移和侵袭。与DHA+NC组相比，DHA+shβ-catenin组显著抑制了U87和U251细胞的迁移和侵袭（P＜0.05）。与DHA+NC组相比，DHA+β-catenin组、DHA+β-catenin(S45)-Mut组分别显著增强了U87和U251细胞的迁移和侵袭力;而DHA+β-catenin(Y333)-Mut组显著抑制了U87和U251细胞的迁移和侵袭。与Control组相比，DHA显著抑制了U87和U251细胞的MMP9、MMP7表达与活性;。与DHA+NC组相比，DHA+shβ-catenin组显著抑制了U87和U251细胞的MMP9、MMP7表达与活性。与DHA+NC组相比，DHA+β-catenin组、DHA+β-catenin(S45)-Mut组分别显著增强了U87和U251细胞的MMP9、MMP7表达与活性;而DHA+β-catenin(Y333)-Mut组显著抑制了U87和U251细胞的MMP9、MMP7表达与活性。在在体动物模型中，DHA(10 mg/kg)能够降低肿瘤体积，抑制U87与U251细胞成瘤能力，pIRES2-β-catenin能够降低DHA抑制成瘤的能力，而sh-β-catenin能够将其增强。⑦染色质免疫共沉淀与萤光素酶报告基因验证β-catenin与MMP7/9的结合。结果提示β-catenin与MMP9、MMP7在预测结合区域均存在结合， 结论：⑴DHA以剂量依赖的方式抑制U87和U251胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。⑵DHA通过提高细胞内ROS水平激活p53蛋白抑制了U87和U251胶质瘤细胞的迁移和侵袭。⑶DHA通过Wnt依赖性方式上调U87细胞的p-β-catenin(S45)，下调β-catenin;或通过非Wnt依赖性的方式抑制EGFR信号通路，下调p-β-catenin(Y333)，进而下调β-catenin。β-catenin下调抑制了MMP7/9的表达与活性，进而抑制了U87细胞的迁移和侵袭。⑷DHA下调U251细胞的MMP7/9的表达与活性，抑制了细胞的迁移和侵袭。在U251细胞中突变型p53能够激活EGFR，同时上调p-β-catenin(Y333)与p-β-catenin(S45)的水平，β-catenin未见明显变化。DHA对MMP7/9的表达与活性的影响不是通过β-catenin调控实现的。