【摘 要】
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鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）、禽流感（Avian influenza,AI）、新城疫（Newcastle disease,ND）、鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）和鸡痘（Fowl pox,FP）是禽常见的重要病毒病。由于IBV有着较大的抗原性差异以及国内广泛的应用针对IBV不同血清型的疫苗,所以分离当地流行毒株并
【基金项目】
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新疆维吾尔自治区自然科学基金项目“新疆野鸭源禽副黏病毒4型毒力相关基因在鸡体内的适应性进化研究”（项目编号:2018D01A13）,课题主持人:刘建华副教授（新疆农业大学）；
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鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）、禽流感（Avian influenza,AI）、新城疫（Newcastle disease,ND）、鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）和鸡痘（Fowl pox,FP）是禽常见的重要病毒病。由于IBV有着较大的抗原性差异以及国内广泛的应用针对IBV不同血清型的疫苗,所以分离当地流行毒株并对其S1基因进行遗传进化分析,对于研究可持续的疫苗接种策略非常重要。IB、AI、ND、IBD及FP具有高度传染性,常发生混合感染或继发感染,建立一种简便、快速能同时检测5种病原的多重PCR诊断方法,有助于禽类疾病的预防和快速诊断。1.从乌鲁木齐市某鸡场无菌采集疑似IB鸡只的组织样品,进行病毒分离鉴定。通过分子生物学试验、血凝特性试验、鸡胚矮小化试验、新城疫病毒干扰试验、鸡胚半数感染量测定、致病性试验及部分理化特性试验表明,分离株在鸡胚上连传5代出现侏儒胚现象并且可以抑制NDV在鸡胚中的增殖,只有经过1%的胰酶处理之后才可对鸡红细胞起到凝集作用,经计算其EID50为10-4.58/0.1m L,为中等毒力毒株,攻毒组较正常组雏鸡气管内有大量粘液且肺脏肿大,表现为呼吸型毒株特征,对热、脂溶剂敏感,对1%胰蛋白酶有一定的耐受性,对酸的耐受性要差于对碱的耐受性。证实该病原为IBV毒株。2.将分离株S1基因测序结果与Genbank已发表参考株S1基因进行遗传进化分析,结果显示,该分离株与IBV/I0221/17/China株关系最近,二者单独形成一个分支,其与TC07-2株、GX-NN09032株、ck/CH/IBTZ株及CK/CH/GD/HY16株形成一个独立的发育进化群,均属于TC07-2/GVI-1型IBV;与国内常用的H120、H52、M41等疫苗株的同源性仅为59%～65%,其S蛋白裂解位点序列为HRRKR,将其命名为IBV/CK/CH/01/2020株。3.依据NCBI核酸数据库中IBV、AIV、NDV、IBDV及FPV基因序列,设计5对特异性引物,优化退火温度、反应循环数和引物浓度,进行特异性、敏感性试验,并进行临床检测。结果表明,建立的多重PCR方法对IBV、AIV、NDV、IBDV和FPV基因组DNA或c DNA均能有效扩增,对鹅细小病毒（GPV）、禽传染性喉气管炎病毒（ILTV）、禽4型副黏病毒（APMV-4）的核酸均无特异性扩增,特异性较强,对IBV、AIV、NDV、IBDV、FPV的重组质粒最低检测限分别为1×105拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×104拷贝/μL,41份自然感染禽样品检测结果与单一PCR的检测的符合率为90.32%,表明所建立的多重PCR检测方法具有较好的特异性、敏感性和临床适用性。本研究主要了解乌鲁木齐某鸡场流行株的变异情况,为阐明IBV遗传变异规律提供实验数据;为鸡5种病毒病单独或混合感染的鉴别提供了一种操作简单、快速的多重PCR方法,对有效预防、控制和扑灭这些禽类病毒病提供技术支撑。
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