西妥昔单抗和帕尼单抗是治疗结直肠癌的有效制剂,但是由于个体基因差异,并非每一个结直肠癌患者都适合使用这两种药物。KRAS基因是编码EGFR下游信号通路的一个基因,对于使用西妥昔单抗或帕尼单抗的患者来说,携带野生型KRAS的患者有较好的应答率,但是携带突变型KRAS的患者的应答率非常小,达不到治疗效果。KRAS的突变主要都是点突变,并且突变点主要集中在2号外显子的第12和13位密码子上,共有7个热点突变,占到KRAS基因上所有突变的90%以上。因此,对这7个热点突变进行快速灵敏的检测对结直肠癌患者有着重大的意义,这不仅可以为患者节省庞大的不必要的开支,也有利于我国对癌症患者实施有效的的个体化用药方案。现在,一种便捷快速且灵敏度高的检测KRAS的方法亟需建立。LDR (Ligase Detect Reaction)是一种比较传统的检测方法,主要原理是利用等位基因特异性引物来进行基因分型,然后通过琼脂糖凝胶电泳对结果进行分析。其缺点是电泳结果不易辨认,有些杂合子条带不明显,且实验耗费时间长,步骤繁琐。Taqman也是现在一种比较常用的检测基因表达的方法,主要是利用Taqman探针上的荧光报告基团和淬灭基团来实时的表现出PCR反应情况。在此基础上我们采用Taqman探针进行PCR来增强LDR结果的准确度,缩短实验时间,可以更直观的观察样品的基因型。并且此方法快速简单,灵敏度可达5%以上,在普通的实验室环境下就可以操作。我们首先制备了KRAS基因的阳性克隆质粒,既可以作为实验阳性质控,也可以进行后续的灵敏度实验。由于我们首先要建立起LDR结合Taqman探针的实验方法,KRAS基因上的7个热点突变难以同时进行实验,因此我们只选用了其13-2位点作为研究对象。针对KRAS13-2位点,我们共设计了2种Taqman探针,分别为特异探针和公用探针,特异性探针分别针对这个位点的野生型和突变型,只能检测13-2这个位点；公用探针设计在这7个突变点的上游,可以检测所有7个突变位点。这2种探针都能够有效检测Kras的基因型。通过实验条件的优化和灵敏度的比较,特异探针和公用探针的灵敏度均可达到5%,这和之前LDR实验的灵敏度差不多,但是结果更为直观可靠。我们也在LDR的基础上改进了原先P1的结构,提高了LDR的连接效率,改善了Taqman探针的检测结果。但是这部分实验需要继续优化条件,以获得更好的实验进展。