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体细胞克隆猪在人的动物疾病模型和人类异种器官移植方面具有巨大的优势和应用潜力,已成为当今体细胞克隆领域研究的热点。本研究以莆田黑猪耳成纤维细胞为供体细胞,猪卵母细胞作为受体细胞,以建立高效的猪体细胞核移植体系为目的,主要优化了卵母细胞体外成熟培养条件,研究了成熟卵母细胞的孤雌激活方法,以及微电极融合法对重构胚融合率的影响,应用开放式拉长细管(OPS)对重构胚胎进行了玻璃化冷冻,结果表明:1、本试验采用出生3～5d的莆田黑猪,采用组织块法培养猪耳成纤维细胞,传代、纯化及冷冻后,得到了大量稳定的供体细胞系。2、对影响卵母细胞体外成熟培养(IVM)的几项因素即卵母细胞的培养方式,石蜡油的添加,不同外源激素的组合及ITS的添加进行研究分析,结果显示(1)凹槽皿组猪卵母细胞成熟率高于四孔板和30mm塑料皿,但差异不显著(P>0.05)。(2)石蜡油的添加对卵丘细胞扩展和卵母细胞体外成熟率均有显著提高(P<0.05)。(3)激素PMSG+HCG+FSH组高于FSH+LH和HMG组(80.1%vs68.3%vs53.3%),相互之间差异显著(P<0.05)。(4)在猪卵母细胞成熟培养液中添加1%ITS(v/v),结果,卵母细胞成熟率没有明显提高,但显著提高了孤雌激活后胚胎的卵裂率和囊胚率(63.3%vs55.1%,18.7%vs12.1%)(P<0.05),说明在卵母细胞成熟培养液中添加1%ITS能够显著提高猪卵母细胞激活后孤雌胚胎发育力。3、为优化并提高卵母细胞的孤雌激活效率,研究了不同浓度离子霉素作用不同时间并联合6-DMAP对猪卵母细胞孤雌激活的影响。结果表明5μM的离子霉素作用4min的卵裂/囊胚率最高(66.7%,13.6%),比较了不同电激活参数对孤雌胚发育的影响,经多次孤雌激活试验表明激活参数120v/mm,60μs,1DC的激活效果最佳。探讨了不同培养基对孤雌胚体外发育的影响,结果表明NCSU-23和PZM-3培养孤雌胚胎卵裂率无明显差异(55.2%,56.1%),但在囊胚率上,PZM-3显著高于NCSU-23(13.8%vs7.84%,P<0.05)。4、为了提高重构胚的融合效率,试验采用微电极融合法,与传统的槽式融合法相比,显著提高了重构胚的融合效率(84.8%vs64.4%,P<0.05),卵裂率和囊胚率无统计学差异(P>0.05)。多次融合激活试验摸索了微电极融合激活的最佳参数为16v,20μs,1DC。5、采用开放式拉长麦管(OPS)玻璃化冷冻克隆胚的桑葚胚和囊胚,结果:解冻后得到了72.3%的胚胎正常形态率。