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第一章胱氨酸/谷氨酸转运体在脂多糖促进肺内谷氨酸释放中的作用目的:研究胱氨酸/谷氨酸转运体（Xc-）在肺内各种细胞上的表达以及其在LPS所致肺细胞Glu释放中的作用。方法:1.以人支气管上皮细胞株（HBEc）、人肺腺癌细胞株（A549）和人胚肺成纤维细胞株（HLF-02）作为人肺支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞和肺成纤维细胞的代表,采用RT-PCR检测这三种肺细胞的Xc-表达。2.应用L-同型半胱氨酸（L-HCA）抑制Xc-及无胱氨酸培养的方法终止Xc-作用,观察在此情况下LPS所致肺细胞Glu释放的变化,以探讨Xc-在LPS所致肺细胞Glu释放中的作用。采用比色法测定培养液中Glu浓度和乳酸脱氢酶（LDH）的活性,反映肺细胞Glu的释放和细胞膜的完整性;比色法检测去除细胞外胱氨酸和L-HCA对LPS所致A549细胞内谷胱甘肽（GSH）含量的影响,以进一步确定对Xc-的阻断效应。3.腹腔注射LPS,观察Xc-抑制剂L-HCA对小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中Glu浓度的影响,进一步在整体水平论证Xc-在LPS致肺细胞Glu释放中的作用。结果:1.0.3～100.0ng/ml LPS处理A549细胞8h可以促进Glu的释放。其中LPS为1.0ng/ml时A549细胞释放Glu最显著,且在作用8h时Glu释放达最大。2.LPS（1.0ng/ml）分别处理A549、HBEc和HLF-02细胞8h,发现LPS可促进这三种细胞释放Glu,其中LPS促进A549细胞释放Glu最显著,与对照组相比增加391.5%。3.同时还测定上述条件培养液中的LDH浓度,与对照组相比无明显改变,提示在本实验所用的LPS浓度和作用时间范围内不会对细胞造成损伤,因而不会发生细胞内的Glu非特异释放。4.RT-PCR证实Xc-的轻链xCT和重链4F2hc mRNA在A549、HBEc和HLF-02细胞均呈阳性表达,正常情况下,HLF-02细胞xCT mRNA表达最明显,HBEc细胞的4F2hc mRNA表达最强。A549细胞Xc-的轻链和重链mRNA在LPS处理后表达增强最为明显。5.A549、HBEc和HLF-02细胞应用L-HCA（0.9mg/ml）预处理30min,再加入LPS作用8h,Glu释放均明显受到抑制。而单用L-HCA对各细胞的Glu释放没有影响。同时证实LPS能够促进A549细胞合成GSH,但在L-HCA干预后GSH的合成显著抑制。用无胱氨酸培基替代正常培基LPS不再能促进A549细胞释放Glu和合成GSH。6.LPS（10.0ma/kg）处理小鼠6h能明显增加BALF中Glu浓度,而L-HCA（4.5mg/kg）预处理30min,BALF中Glu浓度显著降低,与LPS组比较存在显著性差异。结论:1.LPS可促进不同肺细胞释放Glu,且呈现一定的剂量和时间依赖性。2.本研究证实肺的不同种类细胞HBEc、A549和HLF-02上均存在xCT和4F2hc mRNA表达,说明Xc-在肺内不同细胞普遍表达。并且还首次发现Xc-介导LPS所致肺细胞Glu的释放过程。第二章脂多糖促进A549细胞释放谷氨酸机制的初步探讨目的:初步探讨LPS促进A549细胞Glu释放的机制,为急性肺损伤的治疗提供新的靶点。方法:1.以A549为研究对象,初步探讨LPS促进肺释放Glu的机制。分别观察Ca2+螯合剂（EGTA）、基因表达抑制剂放线菌素D（actinomycin,ActD）和一氧化氮合酶抑制剂（L-NAME）预处理后对LPS致其释放Glu浓度的变化,以探讨细胞外Ca2+、基因转录和NO在调节LPS所致肺细胞释放Glu中的相关关系。2.细胞内谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）等与Glu合成相关酶的活性采用生化方法测定,L-谷氨酸脱氢酶（L-GDH）的含量采用ELISA测定,培养基中NO测定采用硝酸还原酶法测定。3.xCT、4F2hc、GOT和L-GDH mRNA的表达采用实时荧光定量PCR进行检测。结果:1.应用ActD（3.5μg/ml）预处理A549细胞30min后加入LPS（1.0ng/ml）继续培养8h,发现A549细胞Glu的释放明显受到抑制。而EGTA（18.7mg/ml）预处理A549细胞30min,则不能抑制LPS所致A549细胞释放Glu。2.1.0ng/ml的LPS不能引起A549细胞NO释放的改变,并且未观察到一氧化氮合酶抑制剂（L-NAME）预处理对LPS所致A549细胞释放Glu增加的影响。3.为了解LPS对肺细胞Glu合成相关酶的影响,本实验观察了A549细胞内GOT、GPT的活性和L-GDH的含量变化。发现LPS增强GOT的活性并可提高L-GDH的含量,但对GPT的活性没有影响。3.实时荧光定量PCR显示LPS上调A549细胞xCT、4F2hc、GOT和L-GDH mRNA的表达水平。结论:1.本实验证实LPS促进A549细胞Glu的释放并上调xCT、4F2hc、L-GDH和GOT mRNA的表达,而mRNA合成抑制剂ActD能明显抑制LPS所致的A549细胞Glu的释放。提示LPS促进A549细胞Glu释放的机制有赖于基因转录的过程。2.LPS所致A549细胞释放Glu增多可能与Glu合成相关酶GOT的活性增强及L-GDH含量增高有关。3.本实验首次证实细胞外Ca2+不参与LPS引起的A549细胞释放Glu。4.本实验首次证实NO不参与低浓度LPS所致的A549细胞释放Glu,表明低浓度的LPS可能通过其他信号传导通路促进Xc-的表达调控。