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心肌细胞,心肌成纤维细胞,平滑肌细胞和血管内皮细胞等心血管系统相关细胞在心肌缺血/再灌注损伤,各种原因引起的心力衰竭,心肌疾病,休克,心血管衰老,心肌肥大,动脉粥样硬化以及血管损伤重塑等病理过程中会产生过量的活性氧族和活性氮族分子,被称为氧化应激。这些活性氧/氮族分子在适量的情况下可作为信号分子参与细胞的正常生理过程。但过量的活性氧/氮族分子却一方面可直接引起细胞功能障碍,另一方面通过激活其下游信号通路相关分子而影响细胞内基因的转录调控进而影响蛋白质表达异常。蛋白质的异常表达是诸多心血管疾病发生发展乃至恶化的分子基础。而寻找氧化应激下游相关信号通路分子作为干预靶点将为心血管疾病的治疗提供新的途径。在真核细胞内普遍存在一类对蛋白质进行多聚ADP核糖化修饰的蛋白酶类家族。其中含量最为丰富的是1型多聚ADP核糖合成酶(poly (ADP-ribose) polymerase1, PARP-1),分子量约为113-116KDa,约占细胞内PARP酶活性的90%。PARP-1作为DNA损伤的感应器和信号分子,当它与断裂的DNA结合后,酶的活性被激活,进而以NAD+作为催化底物,转移其ADP核糖到受体蛋白(如组蛋白,转录因子和PARP-1自身等)。而被修饰的受体蛋白会发生结构和功能的改变。近年的研究发现PARP-1通过调控多种基因的转录调控在多种心血管疾病过程中发挥着重要的作用。在这些疾病的发生发展过程中,PARP-1催化活性明显增强,而在大量的心血管疾病动物模型中,给予PARP抑制剂处理后,可以发现PARP抑制剂发挥了明显的积极有效的作用。本项研究将对PARP-1调节心血管相关基因的转录调控机制和PARP-1抑制剂的干预效果进行探讨,并为PARP抑制剂的临床研究提供理论和试验依据。第一部分PARP-1在人外周血单个核细胞中介导HSP70的表达的机制研究目的：探讨1型多聚ADP核糖合成酶(poly(ADP-ribose) polymerase-1,PARP-1)对炎性刺激物脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导人外周血单个核细胞热休克蛋白70(HSP70)表达的调节作用及其机制方法及结果：1.对培养的正常人外周血单个核细胞分别给予LPS刺激后,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养上清中HSP70的表达水平。使用PARP-1抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide,3AB)预处理细胞后,观察3AB对LPS诱导的HSP70表达的影响。经LPS刺激后,HSP70的表达在不同时间点均显著增高,与单纯LPS刺激组相比,PARP抑制剂3AB预处理细胞后HSP70的表达从18h开始逐渐降低,在24h和48h均显著低于LPS刺激组2.提取培养细胞核蛋白,采用PARP活性检测试剂盒测定培养细胞内PARP酶活性的变化。3AB显著抑制了LPS刺激所致的PARP酶活性的增高。3.提取培养细胞核蛋白,采用凝胶迁移实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMS A)检测核内转录因子热休克因子(heat shock factor-1,HSF-1)的DNA结合能力,并观察PARP-1抑制剂对HSF-1的DNA结合能力的影响。LPS刺激细胞后,HSF-1的DNA结合能力显著增高；3AB预处理细胞后HSF的DNA结合能力明显减弱。4.应用South-western技术检测PARP-1重组蛋白与HSF-1重组蛋白作用后对后者DNA结合能力的影响。HSF-1重组蛋白在与PARP-1重组蛋白相互作用后,DNA结合能力明显增强。5.应用Far-western技术分别检测PARP-1重组蛋白与HSF-1重组蛋白及细胞抽提物中HSF-1之间的相互作用。PARP-1重组蛋白能与HSF-1重组蛋白及细胞抽提物中HSF-1结合。结论：在LPS诱导人外周血单个核细胞产生HSP70的过程中,PARP-1活性明显增高。激活的PARP-1通过调节HSF的DNA结合能力调控了HSP70的表达。第二部分PARP-1在大鼠平滑肌细胞中参与调节TGFβ/Smad3信号通路的机制研究目的：探讨大鼠平滑肌细胞中1型多聚ADP核糖合成酶(poly(ADP-ribose) polymerase-1,PARP-1)对TGF-β信号转导通路中Smad3通路的作用。方法及结果：在大鼠血管平滑肌细胞中,给予TGF-β1处理细胞后能通过诱导ROS的生成激活PARP-1.给以PARP抑制剂,3AB(3-aminobenzamide)或PJ34(N-(6-oxo-5,6-dihydrophenanthridin-2-yl)-2-(N,N-dimethylamino)acetami),或者应用PARP-1siRNA沉默PARP-1能抑制TGF-β1介导的Smad3的磷酸化和核聚集。在给予TGF-β1处理后,通过激活细胞核中PARP-1而促进Smad3的多聚ADP核糖化。对Smad3的多聚ADP核糖化修饰能增加Smad3-SBE复合物的形成,同时也增加Smad3的DNA结合能力。用3AB.PJ34或者PARP-1siRNA预处理细胞后,能阻止TGF-β1介导的Smad3的转录激活和其靶基因的表达。结论：在大鼠血管平滑肌细胞中,TGF-β1介导的Smad3的激活依赖于PARP-1. PARP-1很有可能成为治疗由于TGF-β/Smad3信号通路失调所致的血管纤维化及其他疾病的作用靶点。