论文部分内容阅读
瓜类细菌性果斑病（bacterial fruit blotch,BFB）是一种世界范围内重要的检疫性、种传病害,病原菌为革兰氏阴性细菌-西瓜噬酸菌（Acidovoraxctrulli）,主要为害西瓜、甜瓜等葫芦科作物,具有传播速度快、范围广、发病重等特点,严重限制了瓜类产业的发展,造成巨大的经济损失。Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secretion system,T3SS）广泛存在于革兰氏阴性细菌中,是细菌与寄主植物相互作用过程中的关键毒力因子,参与调节细胞的多种生理生化反应。hpa（hrp-associated）基因是植物病原细菌Ⅲ型分泌系统hrp基因簇的重要组成部分。T3SS分泌蛋白在分泌过程中通常需要hpa基因编码的蛋白质介导,这些蛋白通常有利于植物病原细菌发挥其致病性。为了探究Ⅲ型分泌系统hpaB和hpaA基因在西瓜噬酸菌中的功能,本试验研究对象为西瓜噬酸菌Ⅱ型菌株Aac5,构建基因hpaB和hpaA的缺失突变菌株ΔhpaB和AhpaA及其相应的互补菌株AhpaBcomp和AhpaAcomp,将其与野生型菌株Aac5一起进行致病力和其他致病相关表型的测定,并采用实时荧光定量PCR对T3SS相关基因和致病相关基因进行表达量分析。结果如下:（1）hpaB和hpaA生物信息学关系密切经过生物信息学分析,西瓜噬酸菌hpaB（Aave 0446）和hpaA（Aave0447）基因关系密切,可能存在一定的调控关系。在全基因组图谱上,基因hpaA位于hpaB下游,与hpaB转录方向一致。hpaB基因编码的蛋白质由151个氨基酸组成,功能注释信息为Tir伴侣家族蛋白（Tir chaperone family protein）,HpaB蛋白无特殊结构域;hpaA基因编码的蛋白质由324个氨基酸组成,功能注释信息为假定的蛋白质（hypothetical protein）,其直系同源蛋白质功能注释信息为Ⅲ型分泌调节蛋白（type Ⅲ secretion regulatory protein）,HpaA蛋白结构域由一个卷曲螺旋和一个低复杂度域构成。（2）hpaB和hpaA基因缺失后,影响西瓜噬酸菌致病力及致病相关表型成功构建了目的基因缺失突变菌株ΔhpaB和ΔhpaA及其相应的互补菌株ΔhpaBcomp和ΔhpaAcomp。表型测定结果表明:与野生型菌株Aac5相比,突变菌株ΔhpaB、ΔhpaA对寄主植物西瓜和甜瓜的致病力均显著减弱,并丧失了诱导非寄主烟草HR应答能力（hypersensitiveresponse,HR）,其在寄主体内和体外的生长能力也明显下降。当hpaB基因缺失时,生物膜的形成能力增强,但hpaA基因缺失时,生物膜的形成能力减弱。同时,这两个基因缺失后其运动能力均下降。互补菌株ΔhpaBcomp和ΔhpaAcomp在测定过程中基本均能够恢复这些能力。（3）hpaB和hpaA基因缺失后,影响T3SS相关基因和致病相关基因的表达突变菌株ΔhpaB中,T3SS相关基因（hpaA、hrpE、hrcR、hrpX、hrpG）、毒力蛋白基因trbC及鞭毛基因fliC表达量均显著提高,T3SS基因hrcQ及群体感应相关基因luxR表达量显著下降。突变菌株ΔhpaA中,T3SS相关基因（hpaB、hrpG、hrcV）、毒力蛋白基因trbC、趋化性基因cheA及鞭毛基因fliC表达量显著提高,T3SS相关基因（hrcQ、hrpE）及菌毛基因pilL表达量显著下降,而且基因hpaB和hpaA之间在彼此基因缺失后,基因表达量的变化均极其显著,并且当hpaA基因缺失后,对hpaB基因表达量的影响更显著,推测基因hpaB和hpaA在转录水平上存在一定的调控关系,并能够不同程度地调控以上基因的表达,进而对致病力及致病相关表型产生影响。