植物根系具有从土壤中吸收水分和矿质元素,参与植物与生物或非生物信号的互作,起到固定植株的作用。目前植物根发育分子机制的研究主要集中在双子叶植物拟南芥,关于主要粮食作物水稻的根尖各细胞型的发育过程以及生物学功能研究进展较慢。在植物整个生命过程中,根尖都在不断的分化发育,是非常重要的高异质性器官,传统的高通量测序无法检测不同细胞型的转录组差异,随着单细胞转录组测序(Single cell RNA-seq,sc RNA-seq)技术的飞速发展,使探索单个细胞转录、揭示各类细胞发育过程成为可能。本研究对两个水稻栽培亚种粳稻日本晴Nip(Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare,geng)和籼稻93-11(Oryza sativa L.indica.cv.93-11,xian)根尖细胞进行了单细胞转录组测序和分析,在此基础上绘制了根尖细胞类型发育全景图,并利用核酸组织原位杂交实验对细胞特异性标记基因进行鉴定。1.将Nip和93-11培养3 d的5 mm初生根尖酶解后分别获得了20,000个和16,000个高活力的原生质体,与10x Genomics平台反应试剂混合形成微滴结构进行建库测序。对测序数据过滤,Nip筛选出10,968个细胞,每个细胞平均检测到2,592个基因;93-11筛选出12,564个细胞,每个细胞平均检测到2,636个基因,进行下游数据分析。2.在无监督聚类下将Nip和93-11根尖分成8个细胞型,利用原位杂交技术鉴定出的细胞类型分别是:表皮细胞、内皮层细胞、薄壁细胞、中柱细胞、根毛细胞、根冠、木质部细胞,并发现了一种新的细胞类型—靠近根毛的表皮细胞,位于水稻根尖表皮细胞和根毛细胞中间,为一种过渡型细胞。分型结果中表皮、皮层和中柱是包含2,328至4,833个细胞的主要细胞型,而根毛、初生木质部、根冠和内皮层的簇只有少量细胞(17-435),这与水稻根尖中细胞数量的实际比率相似。本研究发现的根尖细胞特异性标记基因在两个亚种间共享,表明水稻不同亚种在进化过程中较为保守。3.进一步对各细胞类型深入分析发现,生长素(IAA)的合成和响应基因在中柱和表皮细胞中高表达,水杨酸(Salicylic acid,SA)的响应基因、油菜素类固酯(Brassinosteroids,BR)信号通路基因在薄壁细胞中富集;对每个细胞型差异表达基因进行GO富集分析,发现与水和液体运输相关的基因在皮层细胞中富集,与细胞壁相关的基因在表皮中富集,而与对外部刺激的反应相关的基因在表皮(靠近根毛)中富集。本研究还分别检测了Nip和93-11每种细胞型差异表达基因的功能富集,发现大多数基因与环境响应有关,说明Nip和93-11在受到外部环境刺激时响应机制存在差异。4.对水稻单细胞数据进行拟时分析,绘制了根最外层细胞的发育轨迹。根尖表皮分化是以表皮细胞为起点,到分叉点沿两个方向分化,一个分支最终发育为根冠和成熟表皮细胞,另一个分支经历过渡型表皮细胞后最终分化为根毛细胞。5.利用已发表的拟南芥根尖单细胞数据结合水稻单细胞数据集,使用直系同源基因作为锚点进行一一比对,并利用Seurat软件鉴定两物种根尖细胞型的同源性。尽管在两个水稻亚种间细胞类型及激素调控网络类似,但单双子叶进化分析发现拟南芥和水稻之间根的差异较大,只有根毛和木质部细胞相关性较高,物种特异性结果说明同一组织器官在不同物种间进化并不保守。因此,对不同物种组织器官进行单细胞测序研究非常重要。综上所述,本研究绘制了水稻根尖单细胞转录组图谱,为研究水稻根尖的细胞类型、功能和进化开辟了新的途径。