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目的:通过网络药理学技术,初步探索发现药物化瘀通便汤与疾病慢传输型便秘（STC）之间的相关生物过程,其中包括PI3K/AKT/mTOR信号通路;通过体内实验,检测观察化瘀通便汤对复方地芬诺酯诱导的慢传输型便秘大鼠结肠Cajal间质细胞的影响以及对自噬相关蛋白的调控,基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨化瘀通便汤对STC大鼠的作用机制。材料与方法:论文一 基于网络药理学探讨化瘀通便汤治疗慢传输型便秘的作用机制在TCMSP数据库中分别检索化瘀通便汤中13味药物的有效成分,以生物利用度（oral bioavailability,OB）≥3 0%和类药性（drug-like,DL）≥0.18 为筛选条件,运用BATMAN-TCM、SymMap对TCMSP结果进行补充、结合Uniprot数据库,得到该方有效成分的基因靶点。使用Genecards和OMIM数据库分别检索“Slow transit constipation”,将检索结果合并,剔除重复靶点,获得慢传输性便秘的全部基因靶点。使用R语言（R version4.1.1）取得所有药物靶点与慢传输型便秘疾病靶点的交集。将上述交集靶点导入STRING数据库获取蛋白互作网络（PPI）,利用Cytoscape 3.7.1得到“化瘀通便汤-有效成分-慢传输性便秘”的中药调控网络图,将所有数据导入R语言进行模块分析和整体GO生物过程和KEGG通路富集分析。论文二 化瘀通便汤治疗慢传输型便秘的实验研究实验一 STC大鼠模型评价及结肠细胞自噬变化24只SD大鼠称重编号后随机分为4组,分为空白对照组（6只）,模型组Ⅰ（6只）、模型组Ⅱ（6只）和模型组Ⅲ（6只）。造模开始空白对照组以0.1ml/10g给予蒸馏水灌胃,每天灌胃一次。模型组Ⅰ予复方地芬诺酯25mg/（Kg·d）、模型组Ⅱ予复方地芬诺酯50mg/（Kg·d）、模型组Ⅲ予复方地芬诺酯75mg/（Kg·d）,每天灌胃一次,连续造模14天,制造慢传输型便秘模型;造模结束后继续正常食水喂养7天,以巩固实验性慢传输型便秘模型。灌胃期间每周称一次大鼠体重;每日观察记录大鼠精神状态、活动度、毛发、排便情况;观察并记录造模前后及造模完成7天后粪便含水率及首次排黑便时间;统计各组大鼠死亡数量。最后一次观察首次排黑便时间结束后,禁食不禁水24h,1%戊巴比妥钠50 mg/kg充分麻醉后,打开腹腔剪取结肠中间约3cm左右分两段,一段直接放入4%多聚甲醛中固定,另一段放入1.5mlEP管中-80℃冷冻。通过HE染色观察大鼠结肠病理形态变化,蛋白免疫印迹法检测各组大鼠结肠中ICCs特异性表达c-kit、以及自噬标志性蛋白Beclin-1的表达。实验二化瘀通便汤对慢传输型便秘大鼠结肠Cajal间质细胞的影响72只SD大鼠称重编号,计入Excel表格中,以随机数字表法分出12只为空白对照组,其余60只按照第一部分实验得出的复方地芬诺酯最佳造模浓度50mg/（Kg·d）进行造模,造模14天,通过体重、粪便含水率情况判定造模判定成功后,造模的60只大鼠按照实验一分组方法,随机分为模型对照组、化瘀通便汤低剂量组（简称低剂量组,后面中、高剂量相同处理）、化瘀通便汤中剂量组、化瘀通便汤高剂量组,以及西药对照组（莫沙必利组）,每组各12只。根据前文按照人和大鼠间按体表面积折算出灌胃生药量为高剂量组42.3g/（kg·d）、中剂量组21.15g/（kg·d）、低剂量组10.575g/（kg·d）;给药体积按0.1ml/10g计算,根据大鼠平均体重,给药体积为3ml/天/只;同样方法计算西药对照组（枸橼酸莫沙必利）给药剂量为1.35mg/（kg·d）;治疗期间模型对照组、空白对照组灌服等体积量蒸馏水。所有实验组正常进食进水,每日灌胃一次,时间统一在上午9:00-10:00的时间段,连续灌胃治疗14天。观察记录造模前,造模后及治疗后大鼠体重,每日观察记录大鼠精神状况、运动多少,身体毛发的光泽度,以及排便量的多少及干硬情况;观察造模前后粪便含水率及治疗结束后各组碳末推进率;统计各组大鼠死亡数量,记录分析死亡原因。最后一次灌胃治疗结束后,禁食不禁水24h,用8%碳末、10%阿拉伯胶悬液按0.1 ml/10g灌胃,30min后,1%戊巴比妥钠50 mg/kg充分麻醉,打开腹腔迅速剖取自胃底部幽门处至直肠末端肛管上方,测量肠道总长度以及幽门至碳末悬浊液形成的黑色粪便的最低端的肠管长度,拍照记录数值;测量后迅速剪取结肠中间部分约3cm,挤出肠腔内的残留粪便尿液结缔组织等物,PBS缓冲液1×冲洗后,分成三段,第一段放入预冷的2.5%戊二醛中预固定,第二段直接放入4%多聚甲醛中常温固定,第三段放入1.5mlEP管中-80℃冷冻。计算对比各组大鼠粪便含水率、碳末推进率;运用免疫荧光检测结肠组织中c-kit的表达,蛋白免疫印迹法检测各组大鼠结肠中ICCs相关c-kit、HCN1、HCN2蛋白的表达。碳末推进率计算方法:碳末推进距离（cm）/肠道总长度（cm）× 100%。实验三基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨化瘀通便汤对STC大鼠结肠细胞自噬的影响分组造模、给药与标本采集方法同实验二,运用蛋白免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白p-mTOR、p-AKT、p-PI3K的蛋白表达;自噬相关标志性蛋白Beclin-1、Atg5、LC3B、P62的表达情况,得出蛋白条带,测量灰度值进行相对灰度值之间的对比;免疫组化法检测结肠组织中Belin1、P62的表达情况;免疫荧光检测 LC3B 的表达情况;RT-PCR 法检测 mTOR、Beclin-1、Atg5、LC3B 及 P62 mRNA表达情况。结 果:1基于网络药理学探讨化瘀通便汤治疗慢传输型便秘的作用机制经筛选共获得223个满足条件的化合物,其中白术7个,半夏13个,柴胡17个、陈皮5个,赤芍29个,川芎7个,当归2个,甘草92个,麦冬2个,生地2个,桃仁23个,杏仁19个,枳壳5个,共获得靶点1379个,删除重复值后共得到254个靶点。与慢传输型便秘相关疾病基因靶点,经去重后合并得到3985个疾病相关基因;将药物靶点与疾病相关基因取交集,得到药物-疾病共同靶点185个;将上述185个靶基因上传至String平台,可获得核心靶点94个。经R语言运行后,得到KEGG通路富集分析,筛出前20条,其中包含PI3K-AKT信号通路（PI3K-AKT signaling pathway）、mTOR信号通路（mTOR signaling pathway）、自噬动物（Autophagy-animal）等。2 STC大鼠模型评价及结肠细胞自噬变化（1）适应性喂养阶段,24只大鼠精神状态良好、活动较多、毛色顺滑鲜亮、二便调和,粪便粒大饱满。造模开始后,各模型组大鼠相继出现精神状态差、活动少喜扎堆、进食减少、皮毛发黄无光泽、小便不利、粪便粒小而干硬且便量减少、体重增长缓慢,灌胃过程中也可明显感觉到模型各组大鼠相较于空白对照组更加暴躁,抓握鼠背时挣扎明显,部分大鼠出现攻击行为。（2）第一周造模,模型组Ⅰ和模型组Ⅱ无大鼠死亡,模型组Ⅲ有1只死亡;第二周,模型组Ⅰ和模型组Ⅱ无大鼠死亡,模型组Ⅲ死亡1只;整个14天造模阶段空白对照组无死亡,模型组Ⅲ死亡率高达33.333%。（3）与空白对照组比较,三个模型组体质量增长缓慢、排便数量减少、粪便含水率降低、首次排黑便时间延长（p＜0.05）,有统计学差异;相比于模型组Ⅰ,模型组Ⅱ与模型组Ⅲ的体质量、排便数量、粪便含水率、首次排黑便时间变化更明显（p＜0.05）,有统计学差异;而模型组Ⅱ与模型组Ⅲ之间相比,各项指标差异不大（p＞0.05）,说明模型Ⅱ、Ⅲ组便秘症状有差别但差别不明显。（4）造模结束正常喂养七天后,各实验组组内横向对比发现,模型Ⅰ组,造模第14天与造模完成后7天粪便含水率存及首次排黑便时间在差异（p＜0.05）,说明模型组Ⅰ肠道功能有所恢复;而模型组Ⅱ与模型组Ⅲ各自组内对比,粪便含水率与首次排便时间统计有变化但变化不明显（p＞0.05）。（5）HE染色结果显示:空白组无明显病理改变;模型组Ⅰ结肠少许炎性细胞浸润;模型组Ⅱ结肠较多炎性细胞浸润,固有膜肿胀;模型组Ⅲ结肠组织出现大量炎性细胞浸润,固有膜肿胀,粘膜内可见较多淋巴小结。（6）Western Blot检测Cajal间质细胞特异性表达相关蛋白c-kit,以及细胞自噬标志性蛋白Beclin-1的表达,结果显示:随着给药剂量的增加,c-kit表达量逐渐减少,Beclin-1表达量逐渐升高,组间比较（p＜0.01）,有明显的统计学意义,证明STC模型大鼠存在Caial间质细胞损伤,ICCs作为“肠道起搏器”,对肠道的蠕动起到重要作用,STC的发生与ICCs的损伤与减少密切相关;而自噬标志性蛋白Beclin-1升高,说明STC便秘大鼠结肠细胞自噬加剧,ICCs的减少与损伤与细胞自噬的变化同步,说明STC可能由于ICCs的过度自噬使其形态受损数量减少,从而影响结肠功能,导致慢传输性便秘的发生。3化瘀通便汤对慢传输型便秘大鼠结肠Cajal间质细胞的影响（1）进行模型制备以前,72只大鼠精神状态良好、活动较多、毛色顺滑鲜亮、二便调和,粪便粒大饱满,各组体重差别较小,无统计学差异（p＞0.05）;造模开始后,空白对照组12只大鼠各项状态无明显变化,60只造模大鼠相继出现精神状态差、活动少喜扎堆、进食减少、皮毛发黄无光泽、小便不利、粪便粒小而干硬且便量减少、体重增长缓慢,灌胃过程中也可明显感觉到模型各组大鼠相较于空白对照组更加暴躁,抓握鼠背时挣扎明显,部分大鼠出现攻击行为。（2）相较于空白对照组,模型对照组大鼠容易被激惹,体重增加幅度显著降低（p＜0.01）,Cajal间质细胞出现严重损伤,c-kit表达数量明显减少（p＜0.01）,c-kit、HCN1、HCN2蛋白表达能力明显下降（p＜0.01）;（3）治疗14天后,与模型对照组比较,治疗组各组大鼠一般状态有所改善,体重均有所增加（p＜0.05）,有统计学差异;（4）碳末推进率的观察计算发现:与空白对照组相比,模型组大鼠碳末推进率降低明显（p＜0.01）;与模型组相比,化瘀通便汤中、高剂量组以及西药组均有差异（p＜0.05）;与西药组相比,化瘀通便汤中、高剂量组无明显的统计学差异（p＞0.05）;（5）粪便含水率检测:与空白组比较,模型组大鼠含水量明显减少,差异具有统计学意义（p＜0.01）;药物干预2w后,各治疗组与模型组相比含水量明显增多（p＜0.01）;与西药组相比,化瘀通便汤低、中剂量组含水率较低（p＜0.05）,高剂量组则与西药组差异不明显,没有统计学差异（p＞0.05）;（6）透射电镜检查发现:空白对照组大鼠近端结肠ICCs数量较多,形态较好,细胞器丰富,胞浆致密,细胞间连接较多。模型对照组大鼠结肠ICCs损伤,细胞器变性坏死,胞浆轻度溶解,细胞间连接明显减少,连接结构破损。化瘀通便汤低、中剂量组大鼠结肠ICCs形态基本正常,损害较轻,细胞间连接结构稍模糊,细胞器较少,化瘀通便汤高剂量组及西药对照组大鼠结肠ICCs形态相对较好,细胞器和细胞间连接较多。（7）c-kit表达计数比较:各干预组Cajal间质细胞的损伤均有所改善和修复,c-kit阳性细胞数量显著增多（p＜0.01）,化瘀通便汤高剂量组及西药对照组Cajal间质细胞改善和修复明显,c-kit阳性细胞数量增加趋势显著;（8）治疗组c-kit、HCN1、HCN2蛋白表达水平不同程度升高（p＜0.05）,高剂量组及西药对照组c-kit、HCN1、HCN2蛋白表达水平增加趋势显著。4基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨化瘀通便汤对STC大鼠结肠细胞自噬的影响（1）与空白对照组相比,模型组大鼠自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B、Atg5表达上调,P62表达下调（p＜0.01）;与模型组相比,低、中、高剂量化瘀通便汤组均有不同程度的Beclin-1、LC3B、Atg5蛋白表达下调,P62表达上调,其中高剂量组与模型组差相对灰度值有明显差异统计学意义（p＜0.01）;高剂量化瘀通便汤与空白对照组自噬相关蛋白表达结果差别不大（p＞0.05）。（2）RT-PCR检测Beclin-1、LC3B、Atg5、P62基因比变化趋势与Western Blot结果趋势同步,再次加强对结果的验证。（3）与空白对照组相比,模型对照组p-mTOR、p-AKT、p-PI3K相对灰度值明显升高（p＜0.01）,说明模型对照组p-mTOR、p-AKT、p-PI3K表达量增多;与模型组相比,各治疗组p-mTOR、p-AKT、p-PI3K相对灰度值存在不同程度降低（p＜0.01）,其中化瘀通便汤高剂量组与西药对照组积分比值降低程度大,说明各治疗组药物均能不同程度降低p-mTOR、p-AKT、p-PI3K表达,化瘀通便汤高剂量组与西药对照组对作用明显。与西药对照组比较,化瘀通便汤高剂量组p-mTOR、p-AKT、p-PI3K相对灰度值无差异（p＞0.05）,化瘀通便汤中、低剂量组p-mTOR、p-AKT、p-PI3K相对灰度值存在差异（p＜0.05）,说明化瘀通便汤高剂量组与西药对照组降低p-mTOR、p-AKT、p-PI3K表达作用无差异,治疗作用各优于化瘀通便汤低、中剂量组。（4）空白组对照组相比,模型组大鼠mTOR mRNA的表达量增多（p＜0.01）,各治疗组mTOR mRNA的表达量存在不同程度降低（p＜0.01）,其中化瘀通便汤高剂量组与西药对照组积分比值降低程度大,说明各治疗组药物均能不同程度降低mTOR mRNA表达,化瘀通便汤高剂量组与西药对照组对作用明显。mRNA检测结果与Western Blot检测结果趋势整体上一致。结 论:1网络药理学技术研究发现化瘀通便汤与疾病慢传输型便秘（STC）有多条作用途径,其中包括PI3K/AKT/mTOR信号通路,以及自噬相关生物过程。2复方地芬诺酯50mg/（Kg·d）造模稳定性好,安全性高,死亡率较低;且结肠组织病理学检查变化明显,Cajal间质细胞损伤以及自噬标志性的蛋白变化明显;是STC大鼠造模的最优剂量。3 STC模型结肠ICCs形态受损,数量减少,可能与模型组细胞自噬程度加剧有关。4化瘀通便汤可以加快恢复慢传输型便秘大鼠体质量的增长速度,改善和修复Cajal间质细胞使得Cajal间质细胞数量显著增加,修复ICCs形态及功能,从而影响肠道传输功能,治疗STC;其中以化瘀通便汤高剂量组改善作用最明显。5化瘀通便汤能下调p-mTOR、p-AKT、p-PI3K表达,可以通过调节信号通路PI3K/AKT/mTOR,对STC起治疗作用6化瘀通便汤能下调Beclin-1、LC3B、Atg5表达而抑制结肠细胞自噬,上调P62表达促进结肠细胞修复,从而促进肠道蠕动,使得粪便快速排出;7化瘀通便汤对STC大鼠结肠ICCs的影响可能通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路介导的自噬产生,从而对STC起到治疗作用;8化瘀通便汤治疗STC的疗效与用药剂量有关,本次实验的高剂量化瘀通便汤治疗STC效果最佳。