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牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)感染引起的牛、羊、猪、鹿等动物接触性传染病。BVDV感染引起感染动物出现高热、腹泻、白细胞减少、免疫抑制、黏膜充血、繁殖障碍等临床症状，还能引起奶牛产奶量下降、孕牛流产、产死胎以及牛的持续性感染。严重的是，BVDV感染导致幼畜腹泻黏膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD)，致死率高达100%。另外，BVDV还是牛源生物制品(血清、冻精、胚胎、疫苗等)的常在污染源。Occludin，简称为OCLN，是紧密连接相关蛋白(Tight junction，TJ)中最具有代表性的蛋白质之一，直接参与TJs的屏障功能和栅栏功能。大量研究报道，OCLN是丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染靶细胞的重要宿主因子，起到病毒受体作用，介导HCV吸附靶细胞，从而启动病毒复制。而BVDV与HCV同属于黄病毒科，其基因组结构和生物学特性较为相似，而关于BVDV与紧密连接蛋白TJ的作用机制研究尚未见报道。因此，本试验探索OCLN是否在BVDV感染过程中起关键作用？OCLN在BVDV感染中哪些步骤起关键性作用？其机制如何？具体内容如下：
1.BVDV感染MDBK细胞中OCLN基因表达情况研究
结果：发现，BVDV感染MDBK细胞36h后OCLN的mRNA和蛋白水平显著增加；与前期研究使用转录组学测序RNA-Seq建立的BVDV感染靶细胞差异基因表达谱相比，BVDV感染靶细胞造成OCLN基因mRNA水平显著上调结果一致。
结果：发现，转染靶向OCLN基因的小干扰RNA(Small interference RNA，siRNA)48h时显著性降低OCLNmRNA和蛋白质水平，建立qRT-PCR检测BVDV感染OCLN敲低细胞中的BVDV复制水平，发现BVDV5’’非编码区(Untranslated region， UTR)mRNA含量显著性降低；免疫荧光染色检测BVDV感染OCLN敲低细胞的双链RNA(Double strand RNA，dsRNA)含量，发现与阴性对照组相比，OCLN敲低细胞中的红色荧光标记dsRNA含量显著性降低；检测病毒滴度变化发现，OCLN敲低显著性影响子代BVDV颗粒的形成和释放，降低病毒滴度。
3.CRISPR/Cas9技术敲除OCLN基因影响BVDV复制的研究
WesternBlot检测CRISPR/Cas9技术敲除OCLN后其蛋白表达水平，发现OCLN表达显著性降低；基因测序发现OCLN的敲除效率达到73.9%；qRT-PCR检测BVDV感染OCLN敲除细胞中的复制情况，发现BVDV5’’UTRmRNA含量显著性降低；免疫荧光染色发现与对照组相比，OCLN敲除细胞中红色荧光标记的BVDVdsRNA含量显著性减少；BVDV感染OCLN敲除细胞后12、24和48h时，病毒滴度显著性性降低；BVDV感染OCLN敲除细胞后其病毒悬液造成的CPE明显减少；通过BVDV的结合和内化试验，发现CLN敲除后BVDV结合和内化效率显著性降低。
4.紧密连接蛋白OCLN抑制牛病毒性腹泻病毒复制的机制研究
Strep-tag?系统检测发现OCLN与BVDVE2蛋白发生结合，未能与Erns和E1蛋白发生结合；WesternBlot检测发现OCLN-TurboID稳定表达细胞系中OCLN高表达；WesternBlot检测发现biotin最适作用浓度为50μg/mL，处理18h时生物素化蛋白含量最高。生物信息学分析表明：GO功能富集主要在包括肌动蛋白微丝过程(Actin filament-based process)、细胞连接组织(Cell junction organization)和蛋白质在膜上定位(Protein localization to plasma membrane)等。KEGG分析在发现大量与内吞作用相关的信号体通路，其中EGFR、APs、Clathrin、Dynamin、Rab5和EHD3蛋白构成一个蛋白-蛋白互作网络。
本研究发现BVDV感染MDBK细胞造成OCLN基因和蛋白显著性上调，与前期RNA-Seq构建的BVDV感染靶细胞差异转录组表达谱的结果一致；OCLN基因敲低和敲除都显著性阻止BVDVmRNA和dsRNA含量积累、降低BVDV滴度、减弱BVDV感染CPE；同时，OCLN敲除后显著性阻止BVDV结合和内化等感染过程；OCLN作为重要细胞因子，与BVDV囊膜蛋白E2互作，介导BVDV感染，使用邻近蛋白生物素标记技术TurboID和生物素-亲和素系统筛选获得与OCLN互作的蛋白，发现与OCLN互作的蛋白主要富集于细胞内吞等通路，为后续研究OCLN介导BVDV感染的分子机制提供理论依据。
1.BVDV感染MDBK细胞中OCLN基因表达情况研究
结果：发现，BVDV感染MDBK细胞36h后OCLN的mRNA和蛋白水平显著增加；与前期研究使用转录组学测序RNA-Seq建立的BVDV感染靶细胞差异基因表达谱相比，BVDV感染靶细胞造成OCLN基因mRNA水平显著上调结果一致。
结果：发现，转染靶向OCLN基因的小干扰RNA(Small interference RNA，siRNA)48h时显著性降低OCLNmRNA和蛋白质水平，建立qRT-PCR检测BVDV感染OCLN敲低细胞中的BVDV复制水平，发现BVDV5’’非编码区(Untranslated region， UTR)mRNA含量显著性降低；免疫荧光染色检测BVDV感染OCLN敲低细胞的双链RNA(Double strand RNA，dsRNA)含量，发现与阴性对照组相比，OCLN敲低细胞中的红色荧光标记dsRNA含量显著性降低；检测病毒滴度变化发现，OCLN敲低显著性影响子代BVDV颗粒的形成和释放，降低病毒滴度。
3.CRISPR/Cas9技术敲除OCLN基因影响BVDV复制的研究
WesternBlot检测CRISPR/Cas9技术敲除OCLN后其蛋白表达水平，发现OCLN表达显著性降低；基因测序发现OCLN的敲除效率达到73.9%；qRT-PCR检测BVDV感染OCLN敲除细胞中的复制情况，发现BVDV5’’UTRmRNA含量显著性降低；免疫荧光染色发现与对照组相比，OCLN敲除细胞中红色荧光标记的BVDVdsRNA含量显著性减少；BVDV感染OCLN敲除细胞后12、24和48h时，病毒滴度显著性性降低；BVDV感染OCLN敲除细胞后其病毒悬液造成的CPE明显减少；通过BVDV的结合和内化试验，发现CLN敲除后BVDV结合和内化效率显著性降低。
4.紧密连接蛋白OCLN抑制牛病毒性腹泻病毒复制的机制研究
Strep-tag?系统检测发现OCLN与BVDVE2蛋白发生结合，未能与Erns和E1蛋白发生结合；WesternBlot检测发现OCLN-TurboID稳定表达细胞系中OCLN高表达；WesternBlot检测发现biotin最适作用浓度为50μg/mL，处理18h时生物素化蛋白含量最高。生物信息学分析表明：GO功能富集主要在包括肌动蛋白微丝过程(Actin filament-based process)、细胞连接组织(Cell junction organization)和蛋白质在膜上定位(Protein localization to plasma membrane)等。KEGG分析在发现大量与内吞作用相关的信号体通路，其中EGFR、APs、Clathrin、Dynamin、Rab5和EHD3蛋白构成一个蛋白-蛋白互作网络。
本研究发现BVDV感染MDBK细胞造成OCLN基因和蛋白显著性上调，与前期RNA-Seq构建的BVDV感染靶细胞差异转录组表达谱的结果一致；OCLN基因敲低和敲除都显著性阻止BVDVmRNA和dsRNA含量积累、降低BVDV滴度、减弱BVDV感染CPE；同时，OCLN敲除后显著性阻止BVDV结合和内化等感染过程；OCLN作为重要细胞因子，与BVDV囊膜蛋白E2互作，介导BVDV感染，使用邻近蛋白生物素标记技术TurboID和生物素-亲和素系统筛选获得与OCLN互作的蛋白，发现与OCLN互作的蛋白主要富集于细胞内吞等通路，为后续研究OCLN介导BVDV感染的分子机制提供理论依据。