硒是人体必不可少的微量元素之一,硒与很多疾病有关,适量的补硒可以预防和控制心血管、肿瘤等疾病。硒蛋白是微量元素硒以硒代半胱氨酸形式（Sec）进入多肽链的蛋白质。硒的很多生理功能都与硒蛋白的功能密切相关。因此对硒蛋白进行研究,具有重要的现实意义。果蝇硒蛋白G-rich是果蝇体内所含的三种硒蛋白之一,也是果蝇当中唯一细胞定位和分子功能未知的硒蛋白。以果蝇硒蛋白G-rich为研究对象,对其进行克隆,并在原核细胞中进行高效表达,可望填补国内外的研究空白。硒代半胱氨酸（Sec）插入蛋白质的合成过程受其mRNA的编码区内UGA密码子和它下游的茎-环（stem-loop）结构所控制,这种特殊的茎-环结构称为硒代半胱氨酸的插入元件（SECIS）。因此构建含硒代半胱氨酸插入元件（SECIS）的表达载体是本实验的重点。在本研究中,首先利用Primer3等生物学软件设计引物,在基因序列中改变果蝇硒蛋白G-rich编码区中3′端部分密码子的第三个碱基而引入SacⅡ酶切位点,以便插入茎-环结构SECIS。以构建好的载体pAc-G-rich-GFP为模板,以PCR方式扩增目的基因G-rich的编码区,以体外合成方式构建大肠杆菌硒蛋白甲酸脱氢酶H（FDH-H）的茎-环结构SECIS,将它们连接到载体pTNTTM中形成质粒pTNT-G-rich-SECIS。然后再将连接好的pTNT-G-rich-SECIS质粒中的G-rich-SECIS基因片段转到表达载体pGEX-6p-1上,得到高效表达载体pGEX-6p-1-G-rich-SECIS,并在大肠杆菌BL21及Rosetta-gami（DE3）pLysS细胞中进行诱导表达,并对诱导表达条件进行了探讨。研究表明果蝇硒蛋白G-rich能在pGEX-6p-1-G-rich-SECIS转化的含有稀有密码子、有助于目的蛋白形成二硫键的大肠杆菌BL21衍生菌Rosetta-gami（DE3）pLysS中进行表达,诱导表达温度以30℃为佳,且培养基中加入葡萄糖比不加葡萄糖的培养基表达效果好。为了给果蝇硒蛋白G-rich在人体中的基因同源物SelK的细胞定位提供依据,本论文还对硒蛋白G-rich在人体细胞中的细胞定位进行了研究。将G-rich基因片段克隆到pEGFP-N1载体中形成重组载体pEG-rich-GFP,将载体pEG-rich-GFP转染人胃癌细胞823进行细胞定位研究。通过GFP活体荧光显色与内质网荧光染色,应用激光共聚焦扫描显微镜（Laser Scanning Comfocal Microscope, LSCM）确定该蛋白在细胞中的位置。观察表明,果蝇硒蛋白G-rich主要位于人胃癌823细胞株的内质网中,G-rich是否在其它的细胞器中也有表达还需要进一步的验证。果蝇应激蛋白cg10091、cg15745、GstD21在衣霉素（tunicamycin）刺激下,蛋白表达量明显增加,且位置可能在细胞的内质网中,所以对其进行了细胞定位研究。先通过RT-PCR扩增目的基因片段,再连接到pAcPA载体DNA上,转染到果蝇细胞株SL2中,通过GFP活体荧光显色和内质网荧光染色,应用激光共聚焦扫描显微镜确定该蛋白在细胞中的位置,为进一步预测蛋白的功能提供理论基础。研究表明,果蝇应激蛋白cg10091、cg15745、GstD21主要位于果蝇细胞株SL2的内质网中。综上所述,本研究对果蝇硒蛋白G-rich基因进行了克隆,并成功将构建的含有G-rich基因编码序列和大肠杆菌硒蛋白甲酸脱氢酶的SECIS的载体在大肠杆菌表达菌株中进行高效表达。可望在国内外首次获得能通过大肠杆菌大量表达的,具有生物活性的,以及硒代半胱氨酸正确插入的果蝇硒蛋白G-rich,为大量生产单一组分的硒蛋白创造条件。成功的将果蝇硒蛋白G-rich基因克隆到pEGFP-N1载体上,初步确定了其在人体细胞中的位置,为人体硒蛋白SelK的细胞定位提供了依据。首次对果蝇应激蛋白cg10091、cg15745、GstD21基因克隆,并在果蝇细胞中进行了初步定位,为其功能的研究奠定了基础。