目的：　　阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是一种以进行性认知功能障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统(central nervous system，CNS)退行性疾病[1]。虽然AD的病因多样、复杂，但其病理特征却几乎完全一致，即:(1)大脑萎缩、在脑认知区细胞外存在大量由β淀粉样蛋白(beta-amyloid protien，Aβ)高度聚集形成的老年斑(senile plaques，SP)[2]、在神经细胞内形成神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles，NFT)、神经细胞及轴突数量减少、神经元变性死亡;(2)与同龄对照人群相比，AD患者脑微血管扭曲、分支减少、密度下降，血管紧张度降低，血流灌注能力下降，脑内总血流量减少。针对血管的变化，有人提出假说:脑微循环受损可能先于神经元损伤和功能障碍的发生。　　文献报道，多数血管内皮细胞祖细胞来源于单核细胞。这些祖细胞迁移和向内皮细胞分化的能力较低，它们主要的功能是通过调节如血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、集落刺激因子(G-CSF)等血管生长因子的分泌来达到促进血管生成的作用。　　本实验室前期工作发现，与同龄对照人群相比，AD患者外周血单核细胞高表达SecP2（secreting peptide2）。SecP2是一种分泌小肽，它主要来源于人外周血单核细胞（在啮齿类动物中主要表达于脂肪细胞）。目前，有关SecP2的功能了解较少，而单核细胞高表达的SecP2对血管生成可能产生的影响正是我们感兴趣的问题。　　我们初步研究结果显示，SecP2在体外对人脑微血管形成具有抑制作用。这种抑制是否能揭示AD患者脑微循环受损的机制还有待进一步的探讨。　　鉴此，本论文拟研究AD患者单核细胞分泌的SecP2抑制脑微血管生成的机制。　　方法：　　一、研究AD患者外周血单核细胞高表达SecP2对HBMEC血管生成的影响　　（一）比较AD患者及同年龄健康对照者外周血单核细胞中SecP2基因表达的差异　　1、AD患者外周血单核细胞的分离。　　2、利用定量PCR方法验证AD患者外周血单核细胞中SecP2基因表达的变化。　　（二）慢病毒高表达载体的构建　　1、利用慢病毒载体，构建特异性SecP2基因高表达的质粒，制备得到高滴度的慢病毒颗粒。　　2、用慢病毒颗粒转染单核细胞THP-1，建立SecP2基因高表达的单克隆细胞系。　　（三）SecP2表达升高对HBMEC血管生成的影响　　1、模拟AD患者体内环境，用高表达SecP2单核细胞的上清液处理HBMEC，进行血管生成实验。　　2、模拟AD患者体内环境，将高表达SecP2的单核细胞与HBMEC共培养，进行血管生成实验。　　3、不同浓度SecP2蛋白纯品对HBMEC血管生成、增殖和迁移的影响。　　（四）血脑屏障体外模型的建立及HBMEC单层通透性的研究　　1、利用transwell建立血脑屏障体外模型。　　2、不同浓度SecP2蛋白纯品对血脑屏障通透性改变。　　3、Western Blot和Real-time PCR检测粘附连接蛋白VE-cadherin和紧密连接蛋白claudin3、Claudin5、ZO-1以及occludin。　　二、探讨单核细胞高表达SecP2抑制脑微血管生成的机制　　（一）检测SecP2对血管生成相关因子VEGF、FGF及其受体、ephrinA家族及其受体的影响　　利用Western、Real-Time PCR和ELISA检测血管生成相关因子VEGF、FGF及其受体、ephrinA家族及其受体。　　（二）研究ephrin A5对血管生成的影响　　1、ephrin A5蛋白纯品对HBMEC增殖的影响　　2、ephrin A5蛋白纯品对HBMEC迁移的影响　　3、ephrin A5蛋白纯品对HBMEC血管生成的影响　　4、筛选高表达ephrin A5的HBMEC稳定克隆株　　5、高表达ephrin A5的HBMEC稳定克隆株增殖的改变　　6、高表达ephrin A5的HBMEC稳定克隆株迁移的改变　　7、高表达ephrin A5的HBMEC稳定克隆株血管生成的改变　　（三）研究SecP2使HBMEC中ephrin a5表达上调的机制　　1、转录水平　　2、蛋白合成　　3、泛素化　　4、自噬　　（四）探讨VE-cadherin和ephrin a5在HBMEC中表达的关系及其抑制脑微血管生成的机制　　用ephrin a5蛋白纯品处理HBMEC，利用Western Blot和Real-Time PCR检测VE-cadherin的改变。　　三、分析不同发育时期转基因鼠表达的SecP2对脑微血管生成的影响　　（一）单核细胞特异性CD68启动子hSecP2重组质粒的构建　　（二）高表达hSecP2转基因小鼠的获得及鉴定　　分别利用Real-time PCR和ELISA从mRNA和蛋白水平检测转基因小鼠hSecP2的表达量。　　（三）观察SecP2转基因小鼠脑微血管密度及形态的改变　　结果：　　一、AD患者外周血单核细胞中SecP2的表达升高，从而抑制了脑微血管的生成，降低了血脑屏障的通透性。　　1、与同龄对照人群相比，AD患者外周血单核细胞中SecP2基因表达升高。　　2、成功构建特异性SecP2基因高表达的慢病毒载体。　　3、SecP2表达升高抑制HBMEC血管生成，对HBMEC增殖和迁移无明显影响。　　4、SecP2降低血脑屏障体外模型的通透性，粘附连接蛋白VE-cadherin蛋白和mRNA表达水平均升高，紧密连接蛋白ZO-1蛋白表达升高，claudin3、Claudin5、以及occludin蛋白水平均无明显改变。　　二、探讨单核细胞高表达SecP2抑制脑微血管生成的机制。　　1、SecP2对血管生成相关因子VEGF、FGF及其受体均无明显影响;SecP2能使ephrin A5蛋白表达水平升高，但mRNA水平却无明显改变，说明由SecP2引起的HBMEC中ephrin a5表达水平上调与转录水平无关;ephrin A1，ephrin A2，ephrin A3和ephrin A4蛋白水平升高不明显，mRNA水平无明显改变;ephrin A受体EPH A家族中只有EPH A2蛋白表达升高，EPH A1，EPH A3，EPH A4，EPH A5，EPH A6，EPH A7和EPH A8蛋白表达无明显改变。　　2、ephrin A5抑制HBMEC血管生成和迁移，而对增殖无明显影响。　　3、高表达ephrin A5的HBMEC稳定克隆株血管生成和迁移受抑制，而增殖无明显影响。　　4、SecP2可能是通过抑制自噬而使HBMEC中ephrin a5的表达上调。　　5、ephrin a5使HBMEC中VE-cadherin蛋白水平升高。　　三、分析不同发育时期转基因鼠表达的人源性SecP2(human SecP2，hSecP2)对脑微血管生成的影响。　　1、成功构建单核细胞特异性启动子高表达hSecP2的转基因小鼠。　　2、六个月的SecP2转基因小鼠脑微血管密度及分支无明显改变，而九个月的SecP2转基因小鼠有部分脑微血管密度及分支有不同程度的减少。　　结论：　　1、AD患者外周血单核细胞中SecP2的表达升高，从而抑制了脑微血管的生成，降低了血脑屏障的通透性。　　2、SecP2通过使ephrin a5蛋白表达上调，从而抑制了脑微血管的生成。　　3、体内验证转基因小鼠SecP2可能会使脑微血管的生成减少。