目的红细胞是血液的重要组成成分,其主要功能就是通过血液循环来运输氧气到达机体的各个部位,以促进机体的正常运行。但研究证实人成熟红细胞的寿命只有120天左右,为了维持机体内红细胞数量的稳定,成年骨髓中每秒需产生约200万个红细胞,此过程就被称为红系发育。它是从最初的造血干细胞开始,依次经历红系早期分化、红系终末分化以及脱核成熟等三个大阶段,才形成了功能齐全的成熟红细胞。这是一个受到多种机制严格调控的复杂过程,一旦某个发育过程紊乱就会引起相应血液疾病的发生,在对这些血液疾病的研究中,发现诸如真性红细胞增多症等多种血液病病人中,p27kip1(以下简写为“p27”)基因一般都会发生突变,导致其表达量下调,且目前已有多篇文献报道该基因与红系相关血液病有密切联系。因此,在红系发育过程中研究p27基因具有十分重要的实际意义。方法首先运用生物信息学方法对p27及其家族进行基因结构、蛋白结构及表达情况和进化关系等分析。成功构建p27敲低载体并用RT-q PCR来检测其表达,以验证敲低效率。运用血细胞计数法、联苯胺染色法、流式细胞术等方法来检测敲低p27基因后对K562、HEL和CD34+细胞的增殖、分化、凋亡、周期及脱核的影响。结果首先通过生物信息学分析发现,p27基因及其家族成员的进化树共存在6大分支,不同分支的成员之间进化距离差异较小,而成支的成员几乎为同一类型物种;氨基酸序列比对Identity值为40%-60%,说明动物中序列的保守性明显高于植物;最后在结构上都含有多个保守性较高的功能结构域。此外,外周血RNA-Seq数据显示p27基因在早期分化阶段表达量较低,而在红系终末分化阶段表达显著升高。在p27基因敲低后,与对照组相比,实验组K562和HEL细胞连续4天的培养中,细胞生长明显加快,细胞分化则显著减慢,而细胞凋亡无变化。进一步由外周血经磁珠分选得到CD34+细胞,在21天的连续培养中,p27基因敲低也轻微加快了细胞生长,在第6-7天的红系早期分化检测中,CD34+CD36-的BFU-E和CD34-CD36+的CFU-E没有明显变化,在第9-15天的红系终末分化检测中,实验组细胞Band 3和α4 integrin表达减少,此外第14-20天的Syto16染色中阳性细胞也逐渐减少,第14-16天的MGG染色中发现有核畸形细胞出现。结论首先p27及其家族成员广泛存在于动植物中,在动物中保守性更高。其功能结构域在进化上也极为保守。RNA-Seq数据显示p27基因红系终末分化阶段高表达。然后在K562和HEL细胞系中,敲低p27基因会促进细胞生长,抑制细胞分化,促进细胞周期进程,而细胞凋亡无显著性变化。最后在CD34+细胞中,敲低p27基因对细胞生长有轻微促进,对红系早期分化无影响,但对红系终末分化有明显抑制,另外对脱核也有明显抑制且会出现核畸形现象。