论文部分内容阅读
随着纳米科技的迅速发展,纳米材料被广泛应用于很多领域。纳米镍是一种具有高水平表面能量、高磁性、低熔点、低燃点和高表面积的新特性产品,因此其在催化剂、传感器和电子应用等现代工业中得到广泛应用。然而,纳米镍对接触者的潜在危害也得到广泛关注。纳米颗粒的尺寸效应使它们能够容易地运送到生物系统中,从而引发了它们对易感系统的影响。因此,纳米镍对环境和人体健康影响的科学研究势在必行。男性生殖健康已经成为目前环境污染引发的重要问题之一,越来越引起人们的重视,也是目前毒理学研究热点之一。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度一般超过200个核苷酸并且不翻译成蛋白质的RNA转录物,一度被认为是转录“噪音”。但越来越多的研究表明lncRNA在许多生物过程中发挥重要作用,包括细胞分化,细胞命运,增殖和凋亡。我们前期研究发现,纳米镍对大鼠和模式生物秀丽隐杆线虫均具有生殖毒性,尤其对雄性大鼠生殖细胞具有明显损害。进一步研究显示纳米镍可通过诱导细胞凋亡产生生殖细胞损害。但迄今为止,纳米粒子引发生殖细胞损伤机制并不明确,在此过程中涉及的关键分子事件尚未得到探索。因此,本课题选择SD大鼠生精-支持细胞作为研究对象,研究纳米镍对细胞的凋亡作用,探讨lncRNA在纳米镍诱导大鼠生精-支持细胞凋亡中的调控机制。1、纳米镍的表征:扫描电子显微镜(SEM)观察,纳米镍呈球形,粒径在30 nm~100nm间,有团聚现象。透射电子显微镜(TEM)观察发现纳米镍同样呈规则球状,粒径分布在25 nm~125 nm间,有一定团聚且分布不均匀。在分散系(细胞培养液)中,5μg/ml的纳米镍的粒径范围在260 nm~725 nm间,2.5μg/ml的纳米镍的粒径范围在400 nm~879 nm间,峰值分别是444 nm和522 nm。2、纳米镍对大鼠生精-支持细胞凋亡研究:设置空白对照组与25、50、100、200、400、800mg/ml纳米镍染毒组,染毒细胞24 h后,细胞存活率呈剂量依赖性下降;25、50、100、200mg/ml纳米镍溶液染毒细胞24h后细胞核形态发生改变,具体表现为:对照组细胞核呈正常蓝色,处理组细胞核呈致密浓染,颜色发白;随着剂量的增加,凋亡细胞随之增多。流式细胞术发现与对照组比较,25、50、100、200、400μg/ml纳米镍溶液染毒24h后,随着染毒剂量的升高,细胞凋亡率呈剂量依赖性增加。3、高通量基因芯片筛选纳米镍诱导生精-支持细胞凋亡中的差异lncRNA:本研究收集100μg/ml纳米镍溶液染毒大鼠生精-支持细胞总RNA,通过基因芯片筛选出凋亡相关lncRNA,构建lncRNA--miRNA-mRNA共表达网络,结合共表达网络中的贡献度以及芯片检测的差异倍数,从中挑选出6个凋亡相关lncRNA,利用RT-qPCR进行检测,LOC102551356在100μg/ml染毒组表达水平明显上调,与芯片检测结果一致。在凋亡相关lncRNA生物信息学分析以及生物学功能研究的基础上,我们推测LOC102551356可能通过作用于潜在靶基因IGF-BP3从而参与线粒体凋亡途径来影响大鼠睾丸生精-支持细胞凋亡的发生发展。4、LncRNA在纳米镍诱导大鼠生精-支持细胞凋亡中的调控机制研究:通过构建LOC102551356低表达腺病毒载体,研究了大鼠生精-支持细胞腺病毒转染的最佳MOI,大鼠生精-支持细胞腺病毒转染的最佳MOI为300。LOC102551356对纳米镍诱导大鼠生精-支持细胞线粒体膜电位变化的影响:JC-1聚合物与JC-1单体的比例100μg/ml染毒组、阴性对照组均低于空白对照组,而LOC102551356转染组JC-1聚合物与JC-1单体的比例也低于空白对照组,但高于100μg/ml染毒组和阴性对照组;LOC102551356对纳米镍诱导大鼠生精-支持细胞Caspase活性变化的影响:与空白对照组相比,100μg/ml染毒组和阴性对照组Caspase3和Caspase9活性均出现明显上升,而LOC102551356的Caspase3和Caspase9活性与空白对照组比较上升无统计学意义(P>0.05);LOC102551356对纳米镍诱导大鼠生精-支持细胞凋亡的影响:空白对照组凋亡率为2.60±0.82%,100μg/ml染毒组和阴性对照组凋亡率为15.40±1.42%和17.00±2.21%,凋亡率与空白对照组相比,差异显著(P<0.05)。而LOC102551356转染组的总凋亡率为8.30%±1.57%,相较于空白对照组凋亡率也明显升高。但是LOC102551356转染组的总凋亡率低于100μg/ml染毒组和阴性对照组。以上研究表明,LOC10255136在纳米镍诱导大鼠生精-支持细胞凋亡中具有调控功能,可以影响暴露于纳米镍的共培养细胞的线粒体膜电位、Caspase活性和凋亡的水平。100μg/ml染毒组和阴性对照组IGF-BP3基因水平和蛋白表达水平均上调,表明IGF-BP3与纳米镍诱导大鼠生精-支持细胞凋亡存在关联,而LOC102551356转染组IGF-BP3基因水平和蛋白水平与空白对照组比较差异无统计学意义,表明LOC102551356在纳米镍诱导大鼠生精-支持细胞凋亡过程中起到靶向调控IGF-BP3的表达,进而导致细胞凋亡的发生。RT-qPCR结果显示,与空白对照组比较,100μg/ml染毒组和阴性对照组Bax、Caspase3和Caspase9基因水平均上调,Bcl-2基因水平均下调;而LOC102551356转染组Bax、Bcl-2、Caspase3和Caspase9基因水平无显著性变化(P>0.05);100μg/ml染毒组和阴性对照组Bax/Bcl-2基因表达水平的相对比值明显上升,LOC102551356转染组Bax/Bcl-2基因表达水平的相对比值变化差异无统计学意义(P>0.05)。WB实验结果表明,与空白对照组相比,100μg/ml染毒组和阴性对照组Bax、Caspase3和Caspase9蛋白表达水平均上升,Bcl-2蛋白表达水平均下降;LOC102551356转染组Bax、Bcl-2、Caspase3和Caspase9蛋白表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);100μg/ml染毒组和阴性对照组Bax/Bcl-2蛋白表达水平的相对比值也有明显上升,LOC102551356转染组Bax/Bcl-2蛋白表达水平的相对比值与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。这说明LOC102551356靶向调控IGF-BP3的表达后,会影响线粒体依赖的凋亡途径,从而影响凋亡结果。综上所述,纳米镍能诱导大鼠生精-支持细胞凋亡作用,而LOC102551356、IGF-BP3和线粒体凋亡通路在此过程中起到重要作用,可能的调控机制:纳米镍诱导细胞发生凋亡的过程中,LOC102551356表达水平上调,进而通过靶向调控P53信号通路中的靶基因IGF-BP3,诱发线粒体凋亡通路,从而影响凋亡的发生发展。