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目的研究FOXP4-AS1在甲状腺乳头状癌(PTC)组织中表达水平及其与临床病理特征之间的关系;明确FOXP4-AS1在PTC中的具体生物学功能,并初步探究其可能的作用机制。方法(1)生物信息学筛选FOXP4-AS1和甲状腺癌预后的相关性:下载GEO数据库(GENE EXPRESSION OMNIBUS)的GSE66783数据集,并从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)获得33种癌组织和癌旁组织的表达数据和临床数据。使用R studio软件的Limma包及Survival包进行表达差异分析以及生存分析,使用ggplot2包进行数据可视化,筛选差异表达lnc RNAs。分析FOXP4-AS1在33种癌症中的表达差异、临床相关性、生存预后。GSEA分析FOXP4-AS1在甲状腺癌中的富集通路。(2)PTC癌组织标本验证:采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)实验方法检测72例PTC组织及其癌旁组织中FOXP4-AS1的表达水平。分析FOXP4-AS1的表达与患者各项临床病理特征间的关系。(3)细胞实验:RT-q PCR检测TPC-1、K1、BCPAP、Nthy-ori3-1细胞系中FOXP4-AS1表达水平。应用慢病毒感染和si RNA干扰技术,过表达和干扰FOXP4-AS1表达,RT-q PCR实验方法检测过表达和干扰效率。运用CCK8、克隆形成、Transwell、流式细胞术等实验技术检测FOXP4-AS1对PTC细胞增殖、迁移和凋亡的影响;应用RT-q PCR检测过表达和干扰FOXP4-AS1后PTC细胞内BCL-2、BAX、MMP2、MMP9基因表达变化情况,验证其是否参与上述凋亡、迁移过程。RNA荧光原位杂交(FISH)法检测FOXP4-AS1在PTC细胞中的定位。应用Illumina二代高通量测序平台,利用有参转录组测序技术检测FOXP4-AS1过表达前后甲状腺癌细胞株TPC1中全基因组m RNA表达谱的变化。GO分析聚类差异表达基因,KEGG对过表达FOXP4-AS1引起的差异表达基因进行pathway分析,寻找潜在的候选基因和调控机制。Western blot法检测过表达和干扰FOXP4-AS1后甲状腺癌细胞株中PI3K、p-AKT蛋白和总的AKT蛋白表达水平,验证生物信息学和转录组测序中由FOXP4-AS1表达变化引起改变的PI3K/AKT信号通路。(4)动物实验:应用慢病毒感染技术使K1细胞中FOXP4-AS1过表达,实验组及对照组细胞悬液浓度均为1×10~6个细胞/ml,且均以100μl/裸鼠分别注射至裸鼠双腋皮下。皮下移植瘤模型构建成功后,每3天检测瘤体生长指标至种瘤第48天。免疫组化检测肿瘤增殖指数Ki67和p AKT蛋白表达情况以验证体外信号通路。结果(1)生物信息学:通过生物信息学分析并筛选甲状腺癌中存在的差异lnc RNAs,发现FOXP4-AS1在甲状腺癌中低表达,并且与PI3K-AKT-MTOR、细胞周期、细胞凋亡等通路密切相关。FOXP4-AS1的表达量在肿瘤的T分期、N分期、临床分期、腺外侵犯等各临床病理学特征中均有统计学差异(p<0.01),且低表达的患者较高表达患者预后差。(2)PTC癌组织标本:FOXP4-AS1在甲状腺乳头状癌中较癌旁组织显著低表达,其低表达程度分别与PTC患者肿瘤T1/T2和T3/T4期、N0和N1期、Stage I和stage II+III以及腺外侵犯呈显著正向相关(均p<0.05),而与患者性别、年龄、是否远处转移无显著相关性(均p>0.05)。(3)细胞实验:过表达FOXP4-AS1抑制PTC细胞增殖、迁移,诱导细胞凋亡(均p<0.05);凋亡和转移的相关分子指标也发生了相应的变化,抑凋亡基因BCL-2表达减少,促凋亡基因BAX表达增加,促迁移基因MMP2、MMP9表达显著减少(p<0.01)。降低FOXP4-AS1的表达显著促进PTC细胞增殖迁移,同时,显著抑制细胞凋亡(均p<0.01);抑凋亡基因BCL-2表达增多,促凋亡基因BAX表达减少,促迁移基因MMP2、MMP9表达显著增加(p<0.05)。FOXP4-AS1在甲状腺癌细胞核和细胞质均有分布,主要在细胞质中表达。转录组测序GSEA分析显示FOXP4-AS1在肿瘤的标志性信号通路PI3K-AKT-MTOR、KRAS、细胞周期等信号通路中富集。Western blot结果显示过表达FOXP4-AS1后,PTC细胞中PI3K和p-AKT蛋白表达水平显著降低(均p<0.001);干扰FOXP4-AS1表达后PTC细胞中PI3K和p-AKT蛋白表达水平显著升高(均p<0.001),而两组中总的AKT蛋白表达水平均无明显变化(p>0.05)。AKT抑制剂MK-2206能够使干扰FOXP4-AS1表达所诱导的促进PTC细胞增殖、迁移和抑制细胞凋亡的作用减弱(均p<0.05)。FOXP4-AS1是转录因子FOXP4的反义链长链非编码RNA(lnc RNA),lnc RNA可以通过抑制宿主m RNA的表达而发挥功能,是lnc RNA的潜在作用机制之一。本研究发现过表达FOXP4-AS1后,PTC细胞中转录因子FOXP4 m RNA表达明显减少(p<0.01);干扰FOXP4-AS1表达的PTC细胞中转录因子FOXP4 m RNA表达显著升高(p<0.001)。(4)动物实验:过表达FOXP4-AS1组裸鼠皮下肿瘤增殖受到明显抑制,肿瘤增殖指标Ki67和p-AKT的活化水平均显著下降(均p<0.05)。结论(1)FOXP4-AS1在肿瘤组织和非肿瘤组织的表达中具有普遍性差异。FOXP4-AS1在PTC中低表达,且其低表达的程度与PTC恶性进展正相关。(2)过表达FOXP4-AS1可以抑制PTC细胞的增殖迁移,促进细胞凋亡;而干扰FOXP4-AS1可以促进PTC细胞的增殖迁移,抑制细胞凋亡。(3)FOXP4-AS1通过抑制PI3K/AKT信号通路活化来发挥抑制PTC细胞增殖、迁移,诱导细胞凋亡作用。(4)FOXP4-AS1可以负向调控FOXP4,FOXP4可能是FOXP4-AS1在PTC细胞中潜在靶基因。