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1目的通过收集骨关节炎（Osteoarthritis,OA）患者临床数据资料进行挖掘分析,明确OA患者的心功能变化及与免疫炎症指标的相关性,探讨健脾化湿通络法治疗OA心功能变化患者的用药规律,及与超声心动图参数（Echocardiographic parameters,EGP）、实验室指标间的关联性。通过临床体内实验研究,探讨OA患者EGP、免疫炎症指标、细胞因子、miR-23a-3p/10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因/磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR）信号通路指标之间的相关性。通过OA患者CD4+T细胞与软骨细胞/心肌细胞共培养的体外细胞实验,研究健脾化湿通络方-新风胶囊（XFC）含药血清通过调控miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR通路,改善OA患者心功能的生物学机制。2方法2.1回顾性数据挖掘研究基于回顾性数据挖掘方法,筛选安徽中医药大学第一附属医院风湿科2009年5月至2020年6月OA心功能变化患者的病历资料。分析患者实验室指标的变化、处方中涉及中药的性味归经情况和治疗OA心功能变化处方的用药规律。运用SPSS Clementine 11.1软件中Aprior模块分析中药与EGP、免疫炎症指标之间的关联规则,研究健脾化湿通络中药与实验室指标之间的关系。2.2体内实验依据纳入及排除标准,将30例OA心功能变化患者设为实验组,30名正常健康人设为对照组,采用酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测对照组和实验组及OA患者治疗后IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α表达水平,采用实时定量PCR（RT-qPCR）检测对照组和实验组及OA患者治疗后miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路指标。利用spearman分析实验组EGP与免疫炎症指标、细胞因子及miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路指标之间相关性。2.3体外实验分离正常人及OA心功能变化患者外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,提取CD4+T细胞。实验分为7组:control1组:对照组（OA-软骨细胞/正常心肌细胞）,control2组:（正常CD4+T细胞+OA-软骨细胞/正常心肌细胞）,model组:模型组（OA患者CD4+T细胞+OA-软骨细胞/正常心肌细胞）,model+XFC组:模型组+XFC,mimics-NC组:模型组+mimics-miR-23a-3p-NC,mimics组:模型组+mimics-miR-23a-3p,mimics+XFC组:模型组+mimics-miR-23a-3p+XFC。采用CCK-8法检测软骨细胞/心肌细胞的增殖情况,ELISA法检测IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α的表达,RT-qPCR法检测miR-23a-3p/PTEN/PI3K/ATK/mTOR-mRNA表达,免疫荧光（Immunofluorescence,IF）法检测心肌细胞BPN,Connexin 43,Troponin I,Troponin T蛋白的表达,采用蛋白免疫印迹法（Western blotting,WB）法检测PTEN、PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白的表达。3结果3.1回顾性数据挖掘研究3.1.1 OA超声心动图参数与相关指标的相关性分析共纳入住院期间心功能变化的患者有576例（65.16%）,平均年龄（62.75±11.13）岁,男性145例,女性431例。以AODd（47.57%）、SV（45.31%）、LADs（28.29%）升高为主,免疫炎症指标异常以ESR（53.65%）、Hcy（21.35%）、hs-CRP（18.58%）和Ig G（14.76%）升高为主。相关性分析表明,ROVTd与Hcy、hs-CRP呈正相关,AODd、SV与Hcy、hs-CRP和Ig M呈正相关,LADs、RVDd、LVDd与Hcy、hs-CRP和补体C3呈正相关,IVSTd与补体C3呈正相关,以上均具有统计学意义（P<0.05）;二元logistic回归分析表明,Ig G是RVOTd的危险因素;Hcy是AODd、LADs的危险因素,是SV的保护因素;hs-CRP是LADs的危险因素,上述均有统计学意义（P<0.05）。3.1.2基于回顾性数据挖掘探讨中医药治疗OA心功能变化的用药规律及对免疫炎症指标的影响共纳入OA心功能变化的患者有576例,共298味中药,2460张处方纳入研究,所用中药涉及药味包括酸、苦、甘、辛、咸5类,药性包括寒、热、温、凉、平5类,归经包括心、小肠、肝、胆、脾、胃、肺、大肠、肾、膀胱10经;温性药、寒性药和平性药出现最为频繁,温性药、平性药和寒性药使用最为频繁;甘味药、苦味药和辛味药出现及使用最为频繁;肝、肺、脾经的药物出现频率较高,肝、肾、肺、脾经的药使用最为频繁;处方中最常出现的4种功效的药物,清热解毒药出现最为频繁,祛风通络药使用最为频繁;通过聚类分析可将常用药分为三类:炒白术、黄芪、蒲公英、白花蛇舌草、豨莶草、薏苡仁、姜半夏为1类,茯苓、陈皮、桃仁、红花、丹参、山药为1类,当归、川芎、独活、威灵仙、鸡血藤、伸筋草、豨莶草为1类;根据关联规则分析,提升度最高的3组药对分别为红花与桃仁、陈皮与桃仁、陈皮与茯苓。使用中药汤剂的患者有490例,为对照组,平均（62.83±11.25）岁,使用XFC联合中药汤剂的患者有51例,为实验组,平均（62.76±9.23）岁。与本组治疗前相比,对照组治疗后患者免疫炎症指标ESR、hs-CRP和Ig G、补体C3、补体C4均下降（P<0.01）,EGP中EF、FS改善（P<0.05）,实验组患者hs-CRP和Ig G、补体C4下降（P<0.01或P<0.05）。3.2体内实验3.2.1一般情况将30例OA心功能变化患者设为实验组,女性24例,男性6例,平均年龄（57.47±12.95）岁,30名正常健康人设为对照组,男性8例,女22例,平均（56.82±10.21）岁,两组年龄、性别基线差异无意义（P>0.05）。3.2.2两组通路指标及细胞因子的变化与对照组相比,OA心功能变化患者miR-23a-3p、PI3K、AKT显著上调（P<0.01）,而PTEN显著下调（P<0.01）;与对照组相比,IL-1β、IL-6、TNF-α显著升高（P<0.01）,IL-10显著下降（P<0.01）。3.2.3 OA心功能变化患者EGP与信号通路及免疫炎症指标的相关性分析AODd与PTEN呈负相关,LADs与PTEN、PI3K、AKT呈负相关(P<0.01或p<0.05;LADs与Ig A呈正相关（P<0.05）。3.2.4 OA心功能变化患者EGP与相关指标的关联规则分析经Aprior分析发现,AODd升高与IL-10下降、ESR升高呈强关联,LADs的升高与PTEN的下降、miR-23a-3p的升高呈强关联。3.2.5 OA患者相关指标治疗前后变化情况与治疗前相比,服用XFC的OA患者,AODd、LADs和SV有明显改善;与正常组相比,OA患者miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR显著上调,PTEN显著下调,经XFC治疗,OA患者miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR显著下调,PTEN显著上调;与正常组比较,OA患者TNF-α、IL-1β、IL-6显著上调,IL-10显著下调,经XFC治疗,OA患者TNF-α、IL-1β、IL-6显著下调,IL-10显著上调,以上差异均具有统计学意义（P<0.05）。3.3体外实验3.3.1新风胶囊含药血清通过miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR通路改善骨关节炎心功能变化患者CD4+T细胞与软骨细胞共培养炎症反应3.3.1.1 miR-23a-3p与PTEN靶向关系验证Target Scan预测结果显示miR-23a-3p和PTEN的3’UTR区域有结合位点。双荧光素酶报告实验结果显示,与NC组相比,hsa-miR-23a-3p显著下调h-PTEN-3UTR-WT的荧光素酶的表达（P<0.001）。3.3.1.2 CCK-8法检测XFC含药血清对软骨细胞增殖随着时间的延长及浓度的增加,细胞抑制率逐渐增强;而10%XFC在作用48h对OA-CD4+T细胞联合OA-软骨细胞（Chondrocyte,CH）抑制率接近50%。故10%XFC为最佳作用浓度,48h为最佳作用时间。3.3.1.3 ELISA法检测CD4+T细胞与软骨细胞共培养中细胞因子的表达ELISA结果显示:与control1组和control2相比,model组IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显著升高,IL-10显著下降（P<0.01）;与model组相比,XFC组IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显著下降,IL-10显著升高（P<0.01）,mimics组IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显著升高,IL-10显著下降（P<0.01）;与mimics-NC组相比,mimics组IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显著升高,IL-10显著下降（P<0.01）;与mimics组相比,mimics+XFC组IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显著下降,IL-10显著升高（P<0.01）。3.3.1.4 RT-qPCR检测CD4+T细胞与软骨细胞共培养中miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR的表达RT-qPCR结果显示:与control1和control2组相比,model组miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR显著上调,PTEN显著下调（P<0.01）;与model组相比,XFC组miR-23a-3p、PI3K、AKT显著下调,PTEN显著上调（P<0.01）,mimics组miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR显著上调（P<0.01）;与mimics-NC组相比,mimics组miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR显著上调（P<0.01）;与mimics组比,mimics+XFC组miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR显著下调,PTEN显著上调（P<0.01）。3.3.1.5 Western blot方法检测CD4+T细胞与软骨细胞共培养中PTEN、PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白的表达WB结果显示:与control1组和control2相比,model组PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达显著上调,PTEN表达显著下调（P<0.01）;与model组相比,XFC组PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达显著下调,PTEN表达显著上调（P<0.01或P<0.05）,mimics组AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达上调（P<0.01或P<0.05）;与mimics-NC组相比,mimics组PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR显著上调,PTEN显著下调（P<0.01或P<0.05）;与mimics组相比,mimics+XFC组PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达显著下调,PTEN表达显著上调（P<0.01）。3.3.2 XFC含药血清通过miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR通路改善骨关节炎心功能变化患者CD4+T细胞与心肌细胞共培养炎症反应3.3.2.1 CCK-8法检测细胞增殖同一时间点,随着药物浓度的增加,细胞抑制率逐渐增加;10%XFC在作用48h对OA-CD4+T细胞+人心肌细胞（HCM）抑制率接近50%。故10%XFC为最佳作用浓度,48h为最佳作用时间。3.3.2.2 ELISA法检测CD4+T细胞与心肌细胞共培养中细胞因子表达的表达ELISA结果显示:对control1组和control2组相比,model组IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显著升高,IL-10显著下降（P<0.01）;与model组相比,XFC组IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显著下降,IL-10显著升高（P<0.01）,mimics组IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显著升高,IL-10显著下降（P<0.01或P<0.05）;与mimics-NC组相比,mimics组IL-1β、TNF-α表达水平显著升高,IL-10显著下降（P<0.01）;与mimics组相比,mimics+XFC组IL-1β、TNF-α表达水平显著下降,IL-10显著升高（P<0.01）。3.3.2.3 RT-qPCR检测CD4+T细胞与心肌细胞共培养中miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR的表达RT-qPCR结果显示:与control1组和control2组相比,model组miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR显著上调,PTEN显著下调（P<0.01）;与model组相比,XFC组miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR显著下调,PTEN显著上调（P<0.01）;与mimics-NC组相比,mimics组miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR显著上调（P<0.01）;与mimics组比,mimics+XFC组miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR显著下调,PTEN显著上调（P<0.01）。3.3.2.4免疫荧光法检测CD4+T细胞与心肌细胞共培养中BPN、Connexin43、Troponin I、Troponin T的表达蓝色荧光表示细胞核表达,绿色荧光表示被BPN、Connexin43、Troponin I、Troponin T标记的阳性表达部分。免疫荧光结果显示:与control1组和control2组相比,model组BPN、Connexin43、Troponin I、Troponin T阳性表达显著增加（P<0.01）;与model最相比,XFC组BPN、Connexin43、Troponin I、Troponin T表达降低（P<0.01）,mimics组BPN、Connexin43、Troponin I、Troponin T显著增加（P<0.01）;与mimics-NC组相比,mimics组BPN、Connexin43、Troponin I、Troponin T显著增加（P<0.01）;与mimics组相比,mimics+XFC组BPN、Connexin43、Troponin I、Troponin T表达降低（P<0.01）。3.3.2.5 Western blot方法检测CD4+T细胞与心肌细胞共培养中PTEN、PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白的影响WB结果显示:与control1组和control2组相比,model组PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达显著上调,PTEN表达显著下调（P<0.01）;与model组相比,XFC组PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达显著下调,PTEN表达显著上调（P<0.01）,mimics组AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达上调（P<0.01）;与mimics-NC组相比,mimics组PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR显著上调（P<0.01或P<0.05）;与mimics组相比,mimics+XFC组PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达显著下调,PTEN表达显著上调（P<0.01）。4结论4.1 65.16%的OA患者存在心功能变化。主要表现为AODd、SV、LADs的异常,并与Hcy、hs-CRP有相关性,中医药在治疗OA的同时能够改善患者的心功能。健脾化湿通络方新风胶囊联合中药改善心功能的作用更加明显。4.2 OA心功能变化患者miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路、免疫炎症指标与正常健康人之间存在明显差异。OA心功能变化与免疫炎症反应、miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路存在明显相关性。4.3健脾化湿通络中药XFC改善OA心功能的作用机制是下调miR-23a-3p的表达,上调PTEN的表达,抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化;下调促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α,上调抑炎因子IL-10,抑制炎症反应;降低心肌细胞BPN、Connexin43、Troponin I、Troponin T的蛋白表达,从而改善OA患者心功能。