水稻是我国最重要的粮食作物,其产量高低对国家粮食安全和人类日常生活密切相关。叶片是植物进行光合作用的场所,光合能力高低对作物生长发育及产量形成有较大影响;叶色变化会直接影响叶绿体发育与光合作用,进而影响作物产量。水稻产量的最终形成受穗数、穗粒数和粒重3个要素决定,其中粒重受粒形及充实程度的影响。因此,粒形对水稻产量形成具有重要决定作用,同时粒形还会影响稻米品质特别是研磨与外观品质。本实验室在前期构建了籼粳亚种间的染色体片段代换系。在构建过程中,发现了一些具有特异表型的突变材料,如幼苗白化致死突变体和窄粒粒形材料等。本研究就是以这2份材料为基础,通过图位克隆分离了幼苗白化致死基因AL1和粒形基因GS9,并对相关基因的遗传效应与作用机理进行了深入分析。1.水稻幼苗白化致死基因AL1的克隆及分子机理研究叶绿体是植物进行光合作用的场所,其中的核糖体对叶绿体生物合成及幼苗形态建成是至关重要的。目前在高等植物中已经鉴定出许多叶绿体核糖体蛋白(PRP),然而对于这些PRP蛋白在核糖体中的组装机制仍然不清晰。本实验室在以粳稻品种日本晴为受体、籼稻品种9311为供体构建的染色体片段代换系中,发现N150株系在苗期出现正常绿苗和白化苗分离。幼苗白化致死突变体在苗期表现为白化表型,三叶期后逐渐干枯死亡。遗传分析表明,绿色幼苗和白化苗的分离比例符合3:1的单孟德尔因子的遗传规律,证明该白化表型受单个隐性核基因控制。突变体al1表现出叶绿素含量降低、Rubisco蛋白含量显著减少以及叶绿体形态发育异常等表型。白化幼苗突变体中只含有类似前质体的结构,类前质体结构中没有形成任何类似类囊体膜或片层的结构。利用染色体片段代换系N150中分离出的白化苗进行全基因组重测序分析,结果显示白化突变体在第1染色体上含有一段约3.74Mb的纯合导入供体片段,且白化致死表型与这个导入片段紧密连锁,故将白化致死突变体命名为al1。在代换片段区域内发展了 30个分子标记,对1417个白化隐性重组个体进行连锁分析,将目标基因AL/精细定位在分子标记CAPS107和CAPS113之间约42.2 kb的物理范围内。该定位区间内存在7个开放阅读框(ORF),其中ORF1和ORF7在水稻幼苗期可能不表达,另外5个ORF的表达水平在野生型和白化突变体之间没有明显差异。ORF2编码质体核糖体L12蛋白(PRPL12,简称L12),测序比对分析显示ORF2的编码区存在一个自发的单碱基突变(C/T)导致一个氨基酸残基改变(亮氨酸到苯丙氨酸),推测该点突变可能是造成突变表型的原因。转基因互补试验证实,在白化突变体a/1中导入野生型ALl/ORF2基因,能够使其回复正常绿色幼苗表型;RNAi试验表明在日本晴中抑制野生型AL1/ORF2基因的表达,可以产生不同程度的叶色变异,甚至完全白化致死表型。由此证明,ORF2(L12)就是突变产生白化表型的目标基因AL1。AL1/L12基因在叶片中的表达明显高于叶鞘和根等其它组织,其表达受光诱导,且在不同光照条件下保持在一个相对稳定的转录水平。在突变体al1叶片中AL1基因的转录水平与野生型日本晴相似,但其蛋白积累水平远低于野生型。亚细胞定位试验显示,AL1::GFP融合蛋白和al1::GFP融合蛋白都能正确定位于水稻叶绿体内,说明al1突变并没有改变其蛋白的亚细胞定位。生物信息学分析显示,不同物种中50S核糖体蛋白L12具有较高的序列相似性,系统进化树可以大体的划分为两个明显的组,分别定位在叶绿体和细胞质。AL1/L12蛋白编码185个氨基酸残基,al1中点突变位于AL1/L12蛋白的保守结构域,该结构域正好是L12与另一核糖体蛋白L10的结合位点,而且这个点突变在不同物种间是高度保守的。酵母双杂交分析结果表明,AL1蛋白能够与L10蛋白互作,而al1突变蛋白与L10蛋白之间的互作消失;同时发现在酵母中al1突变蛋白的稳定性明显下降,表明al1蛋白点突变不仅影响其与L10的互作,还导致其不稳定。进一步对突变体的表达谱进行分析,发现al1突变体中的细胞质rRNA与野生型无差异,但是叶绿体rRNA的积累则表现出明显减少,说明叶绿体核糖体大小亚基的组装都显著下降。定量RT-PCR和RNA-seq分析数据显示,al1突变体中叶绿体生物合成相关基因表达受严重影响,叶绿体发育相关基因的转录丰度显著增加,光合作用和叶绿素合成相关基因的转录丰度显著下降。突变体中PEP主要亚基RpoA的蛋白水平与野生型中没有显著差异,但叶绿体编码的蛋白PetB、PsaB和PsbA的积累明显下降,说明突变体中大部分叶绿体光合作用相关蛋白的积累都受影响。上述结果为深入了解AL1/L12及其相关蛋白在水稻叶绿体核糖体组装及其作用发挥中的具体功能提供了重要参考。2.水稻粒形基因GS9的精细定位及效应分析粒形不仅影响产量性状,同时也影响稻米品质。本研究在以清芦占11为供体亲本、日本晴为轮回亲本来源的高世代回交群体中发现了一个细长籽粒表型的株系N138。N138成熟籽粒比其轮回亲本日本晴更长、更窄,表现出细长的表型。对N138和日本晴继续回交自交来源的F2分离群体进行分析,发现正常粒型(同日本晴)与窄粒型(同N138)的分离比例符合单个孟德尔因子遗传规律,且纯合野生型和杂合基因型的粒形一致,表明宽粒对窄粒为完全显性,且受由单个核基因控制。通过全基因组重测序分析,发现N138株系中含有来源于供体亲本的6个代换片段。利用这6个代换片段上对应的分子标记对28个表现为窄粒的隐性个体进行连锁分析,结果发现窄粒表型与位于第9染色体的导入片段紧密连锁。因此,将控制该粒形的显性宽粒基因定名为GS9,对应的窄粒等位基因称为gs9。N138中位于第9染色体的导入片段大小约为5.9Mb,在该区域内发展了 10个分子标记,对N138与日本晴衍生的F2和F3代分离群体中筛选到的789个隐性个体进行连锁分析,最终将目标基因GS9定位在分子标记IN0916和IN0919之间约58.9kb的物理范围内,在两个标记处各有1个交换个体,这2个关键交换个体的粒宽明显变窄。基于日本晴基因组信息,在这个定位区间内含有9个开放阅读框(ORF),与目前已经报道的粒形相关基因都不等位。利用N138与日本晴回交自交的后群体中选育获得了一个背景片段全部来自于受体亲本、只在定位区间附近含有较小供体片段的株系,作为GS9的近等基因系NIL(gs9)。与轮回亲本相比,NIL(gs9)抽穗前颖壳表现出变长变窄的表型,长宽差异类似于成熟籽粒表现。对不同发育充实阶段的颖果大小进行观察,结果显示从灌浆第7天开始籽粒大小在两个材料间可以看到明显的差异。细胞学观察证据显示,颖壳大小的差异可能是由于颖壳细胞数目的改变而产生的。对颖壳横向切片观察,发现NIL(gs9)的细胞数目明显少于日本晴;而在纵向切片上NIL(gs9)外稃中部的细胞密度与日本晴没有明显差异,表明NIL(gs9)颖壳变长可能是由于纵向上细胞数目的增加。对日本晴和NIL(gs9)的稻米品质进行比较,表明两个材料成熟种子在主要理化品质,包括表观直链淀粉含量、胶稠度、RVA谱和蛋白质含量等方面均没有显著差异,说明GS9变异对稻米的蒸煮与食味品质没有产生影响。在研磨与加工品质方面,日本晴和NIL(gs9)的糙米率、精米率、整精米率也没有明显差异。在外观品质上,NIL(gs9)精米粒长较日本晴变长、粒宽变窄,长宽比明显高于日本晴;NIL(gs9)的垩白米率和垩白度均低于日本晴。田间试验结果表明,除NIL(gs9)株高稍矮外,植株表型与日本晴无显著差异,各项主要农艺性状之间也没有显著差异;NIL(gs9)的小区产量与日本晴一致。综合上述数据,表明gs9等位基因可在不影响株型及稻米主要理化品质的前提下进一步改良外观品质。利用RNA-seq技术对NIL(gs9)和日本晴幼穗中的表达谱进行比较分析,显示在NIL(gs9)幼穗中有许多与日本晴差异表达的基因,这些差异表达基因主要富集在转录因子活性、核酸物质结合能力、结构分子活性、运动活性、脂类结合能力等途径上。定量RT-PCR分析结果显示,gs9变异可影响细胞周期相关基因表达,进一步证实该变异是与细胞数目和大小有关;此外,比较了 NIL(gs9)和日本晴幼穗中调控籽粒大小相关基因的表达水平,推测GS9的作用机制可能与油菜素内酯合成及信号通路有关。上述相关结果为克隆GS9基因及其作用机理研究奠定了基础。