中温大曲原核微生物群落解析及高产淀粉酶菌株的筛选与应用探究

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中温大曲作为浓香型白酒生产过程中重要的糖化剂和发酵剂,含有丰富的微生物及多种酶系,在白酒酿造中发挥着糖化、发酵、生香等关键作用。淀粉酶是大曲糖化作用主要的贡献者,是水解谷物原料的重要酶类,淀粉酶系活力的高低是影响原料利用率和出酒率的重要因素之一。本研究使用高通量测序技术结合可培养技术对中温大曲不同发酵节点(0天、3天、9天、13天、30天)原核微生物群落进行了解析,从中筛选出一株高产淀粉酶菌株DQ47,并对其生长条件及产酶条件进行了优化,通过制成液态曲和麸曲两种形式将其运用到小曲酒模拟酿造中。主要研究结果如下:(1)利用高通量测序技术解析中温大曲发酵过程中细菌群落结构、功能及表型变化。结果表明,中温大曲优势菌门为Firmicutes,Proteobacteria,Bacteroidetes,Actinomyces等;优势菌属为Welchiella、Staphylococcus、Escherichia、Lactobacillus等。大曲样品可聚类为3类,0天和3天样品(前期)、9天和13天样品(中期)、30天样品(后期)。发酵前和发酵后期的微生物生长繁殖能力高于发酵中期微生物,发酵中期菌群对原料中的淀粉和蛋白质等利用率更高。发酵前期是革兰氏阴性的兼性厌氧菌,中期是革兰氏阳性的好氧菌,后期是革兰氏阳性的厌氧菌,具有移动原件的菌群在整个发酵过程中呈现先增加后降低的趋势。整个发酵过程中芽孢杆菌属的平均相对丰度较底,不属于优势菌属,但其在发酵过程中相对丰度逐渐增大,尤其在发酵后期,相对丰度达到最高0.94%。(2)通过可培养手段从中温大曲样品中筛选137株细菌,分属于11个属,Bacillus、Staphylococcus、Paenibacillus、Myroides、Pseudomonas、Proteus、Kosakonia等,其中属于芽孢杆菌属的菌株数最多为111株。用水解圈法初筛,发酵复筛,得到一株高产淀粉酶枯草芽孢杆菌DQ47,并以此为出发菌株做后续实验。(3)通过微生物发酵测定菌株DQ47产酶周期为8天,利用单因素实验及响应面实验对DQ47发酵条件进行优化,获得最佳优化方案:碳源可溶性淀粉,碳源浓度60 g/L,氮源酵母粉,氮源浓度37 g/L,发酵温度39℃,装液量和转速分别为34%,175 r/min,初始p H值6,接种量3%,优化后淀粉酶活力达到8158.23 U/m L,是优化前的14.75倍。将产物淀粉酶分离纯化并研究其酶学性质,该酶在80%的盐析度下回收率最高,淀粉酶纯化后获得蛋白纯化倍数为3.74,回收率为19.74%,电泳后测得蛋白相对分子质量为61.2 KDa,酶学性质研究结果表明,该酶的最适反应温度为65℃,最适p H值为6,金属离子及EDTA对酶的活力影响实验结果显示,1 mmol/L的Zn2+、Mg2+、Mn2+对淀粉酶具有激活作用,Na+、K+、Ca2+、Fe2+、EDTA对淀粉酶具有抑制作用。(4)在小曲酒模拟酿造中,将DQ47制成细菌麸曲对其进行单因素实验和正交优化实验之后得出最佳发酵条件为:发酵时间72 h,培养基最佳配比(麸皮:豌豆)为4:1,发酵温度为40℃,含水量为50%,接种量为15%,原料添加量为5 g,按照此工艺条件下进行三次验证试验,得到的酶活为(58479.23±120.45)U/g。将产淀粉酶菌株DQ47制成的麸曲和发酵液,添加到小曲酒的酿造中,测定发酵过程中酒醅理化(温度、含水量、p H值、总酸、总酯、还原糖、淀粉),得出实验组的各项测定指标均优于对照组,测定酒体理化,得出实验组的酒精度、出酒率、总酸、总酯均高于对照组,且添加细菌麸曲后的实验组出酒率比对照组提高了7.4%,添加发酵液发酵液后的实验组出酒率较对照组提高了2.7%,此外,实验组总酸、总酯含量及风味物质种类和含量也均有提高。本研究主要针对河南地区浓香白酒中温大曲微生物群落进行解析,从中获得一株高产淀粉酶菌株,通过研究其产酶条件及应用,以期为提高白酒酿造过程中淀粉质原料的利用及白酒的出酒率提供一定的理论及实践依据。
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