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背景:
γ干扰素(IFN-γ)是干扰素大家族一员,属于Ⅱ型干扰素[1,2],又称为免疫干扰素。是机体在接触病毒或其他诱生剂后分泌的一类蛋白,具有广谱抗病毒、抑制细胞增殖和双向免疫调节等多种生物学活性。在抗肿瘤、治疗自身免疫性疾病方面有着广泛的应用前景。IFN-γ主要由活化的T细胞和NK细胞产生,人IFN-γ基因定位于第12号染色体,为分泌型蛋白,分泌信号肽被切除后的成熟蛋白分子由143个氨基酸组成,分子量为40kD,以同源二聚体或四聚体形式存在.其N末端与IFN-α/β受体有一定的同源性[3]。IFN-γ生物学作用有较严格的种属特异性,例如:人和小鼠IFN-γ在DNA水平上有65%左右同源性,在氨基酸水平的同源性只有40%左右[4]。人IFNγ只作用于人或灵长类动物细胞,可诱导单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞、星状细胞等MHCⅡ类抗原的表达,使其参与抗原提呈和特异性免疫的识别过程[5]。
IFN-γ的抗肿瘤细胞增殖、抑制血管生成和免疫调节效应使之成为一个受到广泛关注的抗肿瘤药物[6-8]。IFN-γ能显著地抑制多种肿瘤的生长,并已应用到临床试验中,但是由于它的不稳定、半衰期短、活性低,分布在肿瘤组织的IFN-γ往往达不到治疗效果,加大IFN-γ的治疗剂量,又产生了严重的全身毒副作用,例如局部缺血性心脏病、心肌病、肾病综合征,严重的可发生急性肾功能衰竭。为了克服这些缺点我们利用肿瘤细胞表面易于生物素化和链亲和素与生物素能高效而超强结合——这两个特性,制备链亲和素(SA)标记的人IFN-γ融合蛋白并研究其生物学功能[9]。
目的:
利用本室早期构建的SA-L-hIFNγ-pET24a重组表达质粒在大肠杆菌中表达融合蛋白SA-hIFN-γ,并对其生物学功能进行鉴定。
方法:
重组人SA-IFN-γ双功能融合蛋白在大肠杆菌中表达,对所表达的融合蛋白采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析进行纯化,通过银氨染色,凝胶成像扫描方法检测其纯度,并将融合蛋白进行梯度透析复性,免疫印迹分析鉴定。采用A549-VSV系统,通过细胞病变(CEP)效应为基础的结晶紫染色法测定复性后SA-hIFN-γ的活性,利用流式细胞术(FCM)分析融合蛋白对生物素化的小鼠前列腺癌细胞RM-1表面锚定修饰效率。
结果:
SA-hIFN-γ在大肠杆菌中实现了高效表达,目的蛋白约占细菌总蛋白的55%。制备的SA-hlFN-γ融合蛋白纯度达到96%,复性后的融合蛋白最高浓度为90ug/ml。并具有双重活性,即:SA-hIFN-γ抗VSV病毒比活性为2.17×105U/mg和SA介导的高效结合至表面已生物素化的RM-1细胞的功能(表面锚定修饰效率为98.6%)。
结论:
本文成功的将已构建的SA-L-hIFNγ-pET24a重组表达质粒导入大肠杆菌中表达并获得包涵体,通过纯化获得高纯度的融合蛋白,并在细胞病变(CEP)实验和细胞锚定实验中初步检测了SA-hIFN-γ双功能融合蛋白所具有得生物学活性。进一步为后续的体内生物学作用以及工业化生产奠定基础。