目的:人巨细胞病毒（HCMV）属疱疹病毒属β亚科,世界范围内人群感染率为50%-90%。初次感染后形成潜伏感染并持续终生。现有研究认为,HCMV潜伏的主要部位是造血干细胞-单核细胞。潜伏再激活过程与HCMV的部分基因（例如LUNA与UL138）相关,同时与单核细胞分化过程相关。但是,对于再激活机制的研究目前并不完善。潜伏的HCMV在免疫低下时再激活,可以引起严重症状。如在妊娠期感染可引起胎儿巨细胞包涵体病,少数患儿呈小头畸形、智力低下,严重者可致流产,死胎。围生期感染可能导致新生儿黄疸,听力下降。器官移植患者的再激活可能导致移植失败甚至死亡。揭示潜伏HCMV活化的机制将对控制与阻断再激活起到重要作用。本研究在潜伏感染细胞模型及自然感染细胞中,探索了HCMV活化过程中的重要因素,包括细胞分化、受体、细胞间相互作用等方面,并初步研究其机制。HCMV基因组为双链DNA,全长230kb。预测有750个可翻译的开放阅读框（Open reading frame,ORF）。在以前的研究中,通过northern杂交从Merlin株的UL16-17区域检测到三种长度的转录本。通过c DNA 5’末端快速扩增（5′RACE）和深度测序对AD169株与Towne株的UL16和UL17的转录情况进行了初步分析。然而,UL16和UL17转录终止情况与UL17的转录时相仍然是未知的。转录起止位点与转录时相信息的缺乏会在基因外源表达或基因改造领域影响对蛋白功能的研究。本研究通过文库筛选、RACE和northern blot技术,集中研究了UL16-UL17区域转录本结构,为将来UL16与UL17的功能研究提供了准确的转录本信息。方法:1、HCMV在单核细胞与成纤维细胞中感染率的差异及原因研究。使用HCMV感染单核细胞系THP-1,之后维持培养或者传代培养,得到HCMV潜伏感染单核细胞的模型。使用实时定量PCR（Real time quantitative PCR,q PCR）技术,分析HCMV对THP-1的感染率。使用流式细胞分选与磁珠细胞分选技术获得外周血中的造血祖细胞与单核细胞,使用PCR检测两种细胞中HCMV DNA的存在情况。使用q PCR技术检测HCMV主要受体以及细胞内吞相关蛋白小窝蛋白（Caveolin 1,CAV1）m RNA转录水平,分析受体差异对成纤维细胞与单核细胞感染率差异的影响。使用慢病毒技术构建稳定表达血小板来源生长因子受体α（Platelet Derived Growth Factor Receptor Alpha,PDGFRA）及CAV1的THP-1细胞系。通过q PCR和免疫荧光技术（Immunofluorescence,IFA）检测稳定转染细胞系中PDGFRA与CAV1的表达与定位,分析稳定转染的效果。使用q PCR检测HCMV感染率,评估其对HCMV感染率的影响。2、HCMV在单核细胞与成纤维细胞中转录水平的差异与原因研究。使用逆转录PCR（Reverse transcription PCR,RT-PCR）技术,检测THP-1潜伏模型中HCMV基因随着时间转录变化趋势。使用密度梯度离心技术分离HCMV活动性感染者外周血单个核细胞,使用10X单细胞测序技术对单个核细胞进行m RNA深度测序,分析HCMV在自然感染个体单核细胞中的基因转录情况,同时分析HCMV在不同类型细胞中转录水平的差异。使用质谱分析技术对HCMV感染状态不同的细胞系进行检测,通过生物信息学分析,获得不同细胞系中差异表达的蛋白组,分析HCMV在单核细胞中转录被抑制的可能原因。3、HCMV从潜伏感染状态中活化的条件与因素研究。使用佛波酯（12-O-Tetradecanoylphorbol 13-acetate,TPA）诱导THP-1细胞分化成巨噬细胞,结合PCR与q PCR技术,分析细胞分化对THP-1感染率的影响,以及分化对潜伏HCMV复制的影响。使用病毒滴度测定技术,检测分化前后THP-1细胞培养液中释放的子代病毒的滴度,分析细胞分化对HCMV活化的作用。通过HCMV感染的THP-1细胞与人包皮成纤维细胞（Human foreskin fibroblasts,HFF）共培养方法,结合PCR,q PCR与病毒滴定技术,分析细胞间相互作用对于HCMV活化的影响。4、UL16,UL17转录本结构研究。采用基因特异性引物在c DNA文库中筛选UL16,UL17转录本。采用northern杂交技术验证Han株和AD169株中UL16和UL17的转录时相。采用RACE方法鉴定UL16-17区的转录起止位点。通过生物信息学技术分析UL16-UL17基因区域的启动子、转录终止信号等转录调控元件。结果:1、HCMV在单核细胞中感染率低,部分原因是因为HCMV受体表达水平低。在THP-1中,当MOI=10时HCMV Han株的感染率低于1%。在HCMV Ig G抗体阳性感染者的CD34+造血祖细胞和CD14+单核细胞中,使用一轮PCR未检测到HCMV DNA,使用巢式PCR可偶尔检测到HCMV DNA。已知的HCMV受体,PDGFRA,NRP2,EGFR在HFF中高转录,在THP-1中低转录。单独过表达CAV1没有提高HCMV对THP-1的感染率。单独过表达PDGFR可以小幅度提高Han-BAC株对THP-1的感染率。2、在单核细胞中,HCMV的转录活性受到细胞抑制。HCMV感染THP-1细胞后,在传代培养和维持培养两种方式中,HCMV的各种基因转录都呈现逐渐减少趋势。在活动性感染患者的11593个单个核细胞（包括1244个单核细胞）中,没有检测到HCMV特异性m RNA。与潜伏感染细胞系THP-1相比,支持裂解感染的细胞系（HELF,ARPE-19,U373）中表达量高的蛋白主要富集在细胞骨架组装与细胞分化方面。与三种支持裂解感染细胞系相比,THP-1中高表达的转录因子包括REL,NFATC2,MEF2D,IRF5,ELF1。3、细胞分化及与敏感细胞接触促进单核细胞中的HCMV活化。实验室条件下,TPA预处理使HCMV在THP-1中的感染率上升4倍。使用TPA处理感染了HCMV的THP-1细胞,使HCMV的DNA复制水平提高8倍。与HFF共培养可以使THP-1中的HCMV活化并且产生子代病毒;TPA处理可以提高共培养导致HCMV活化的速率。4、在Han株和AD169株中,UL16-17区主要转录为3簇3’端相同的转录本,3簇转录本的核心转录本长度分别为1254nt、718nt和468nt。在HCMV-Han基因组中UL16-17区主要转录本的5’端分别位于nt23119、nt23655、nt23905,共用的3’端位于nt24372。其中UL16-17区的1254nt和468nt转录本在早期和晚期转录,而718nt转录本仅在晚期转录。结论:HCMV对造血祖细胞,单核细胞和THP-1感染率低;感染率低可能是由于HCMV主要受体表达量低所致。HCMV的不同基因在THP-1感染过程中转录趋势没有明显的差别。TPA处理可以提高THP-1对HCMV感染的敏感性。与HFF共培养可以使THP-1中的HCMV活化。UL16-UL17基因区域主要转录成3簇转录本,转录本结构与转录时相在Han株与AD169株中没有明显区别。