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肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)是一种以肺血管重塑和进行性升高的后负荷为特征的综合征,可导致右心肥厚,进一步会导致右心衰竭和死亡。O-Gal NAc型糖基化修饰在调控蛋白质生物功能中发挥至关重要的作用。Tn作为一种截短的O-Gal NAc聚糖产物,由Gal NAc转移酶(Gal NAc transferase,GALNT)家族催化合成。Tn参与调控血管生成、上皮间充质转化、细胞与细胞间的粘附和细胞迁移,而这些表型也同样出现在PH中。GALNT1和GALNT13基因的表达与评估PH的重要指标—右心室收缩压(right ventricular systolic pressure,RVSP)升高显著相关。GALNT1和GALNT13蛋白质序列相似度高达84%,两者在催化底物时具有冗余性。目前,O-Gal NAc型糖基化修饰在PH中作用尚不清楚。本研究旨在探讨GALNT1和GALNT13介导的截短的O-Gal NAc聚糖(Tn)在PH中的作用及机制,为PH治疗提供更多的理论依据和潜在靶点。本研究利用免疫印迹、免疫组化以及定量PCR技术检测GALNT1、GALNT13以及Tn在PH中的表达,并确立其是在哪种肺血管细胞类型中发挥主导作用;利用免疫印迹及荧光素酶报告试验检测低氧是否调控GALNT1和GALNT13的转录和表达;利用过表达和基因沉默检测GALNT1和GALNT13在Endo MT进程中的作用;免疫共沉淀以及VVL免疫沉淀技术检测TGFβRI是否GALNT1和GALNT13介导的O-Gal NAc糖基化靶蛋白;利用内皮特异性敲除Galnt1和Galnt13敲除小鼠以及品系Galnt13敲除大鼠评估其对小鼠低氧-PH及大鼠MCT-PH的改善作用;利用MCT-PH模型和Hyp/Sugen模型中评估靶向药物治疗PH的作用。主要研究内容和结果如下:1.GALNT1和GALNT13及其介导截短的O-Gal NAc聚糖(Tn)在PH患者的表达。免疫印迹和免疫组化结果显示,GALNT1及Tn的表达在PH患者的肺组织中显著升高。定量PCR结果显示,在GALNT20个家族成员中,GALNT1在肺动脉内皮细胞(pulmonary artery endothelial cells,PAEC)中的表达显著高于其他成员;而GALNT13在PAEC和肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMC)中的表达量均极低。免疫印迹和定量PCR结果显示,GALNT1蛋白和GALNT1 m RNA水平在PAEC中显著高于PASMC;且相比于对照组,GALNT1在PH患者的PAEC中显著上调。目前,商业化的抗体不能特异性检测内源表达的GALNT13,故结果不涉及内源性GALNT13免疫印迹结果展示。免疫印迹和定量PCR结果显示,GALNT1和Tn的水平及Galnt1 m RNA的表达在MCT-PH大鼠的肺组织中显著升高。结果表明,GALNT1及Tn表达上调与PH发生发展相关,且主要通过PAEC发挥作用。2.低氧调控GALNT1和GALNT13的作用机制。免疫印迹结果显示,GALNT1在低氧-PH小鼠肺组织中上调,而Tn表现上调趋势。1%O2和不同浓度的DMOG处理显著上调HIF2α、GALNT1和Tn在PAEC的表达。荧光素报告试验结果显示,HIF2α与GALNT1和GALNT13启动子区结合增强其转录。结果表明,低氧通过稳定HIF2α的表达调控GALNT1和GALNT13的转录,并增加Tn表达。3.GALNT1和GALNT13调控Endo MT的作用及机制。免疫印迹及免疫荧光结果显示,GALNT1和GALNT13过表达后显著增加Tn在PAEC的表达。免疫印迹结果显示,GALNT1和GALNT13过表达后显著下调VE-cadherin,并上调α-SMA和TGFβRI在PAEC的表达。GALNT1基因沉默结果与之相反。免疫共沉淀结果显示,GALNT1和GALNT13可以在与TGFβRI和TGFβRII在体外结合。VVL免疫沉淀结果显示,相比于WT细胞系,TGFβRI在SC细胞系中与VVL结合的量增多;相比于SC细胞系,TGFβRI在SC/GALNT1 KO和SC/GALNT13 KO细胞系与VVL结合的量显著下降。结果表明,GALNT1和GALNT13通过调控Tn水平参与Endo MT进程,且TGFβRI作为GALNT1和GALNT13催化的O-Gal NAc糖蛋白底物在这一过程中起关键作用。4.Galnt1和Galnt13敲除对小鼠低氧-PH和大鼠MCT-PH的治疗作用。Galnt1EC-/-显著降低低氧-PH小鼠的RVSP、RV/(LV+S)、RV/BW和肺动脉血管厚度。超声心动图结果显示,Galnt1EC-/-显著降低低氧-PH小鼠的PAD,并升高PAT/PET、FAC%,TAPSE以及S’等参数。然而,Galnt13EC-/-没有显著降低低氧-PH小鼠的RVSP、RV/(LV+S)、RV/BW和肺动脉血管厚度,且Galnt13EC-/-对PAD,PAT/PET、FAC%,TAPSE以及S’等参数无显著影响。此外,Galnt13-/-可显著降低MCT-PH大鼠的RVSP、RV/(LV+S)及肺动脉血管厚度。免疫印迹结果显示,与MCT组WT大鼠相比,MCT组Galnt13-/-大鼠肺组织中Tn和α-SMA下调,VE-cadherin上调。结果表明,Galnt1而不是Galnt13在内皮细胞特异性敲除显著缓解小鼠低氧-PH,且对右心室功能起到保护作用。这与体外细胞实验结果吻合,表明GALNT1在调控内皮细胞功能参与的PH发展中发挥主导作用。然而,Galnt13-/-可通过下调MCT-PH大鼠肺组织高水平的Tn而抑制Endo MT进程,进而抑制大鼠MCT-PH的发展。这表明,GALNT13很有可能通过其他类型细胞参与PH发展,具体机制有待进一步研究。5.Imatinib联合rapamycin对大鼠MCT-PH和Hyp/Sugen-PH的治疗作用。免疫印迹结果,rapamycin长期暴露会显著抑制m TORC2,并激活PDGFR信号通路;而Imatinib可显著抑制由rapamycin激活的PDGFR信号通路。细胞增殖试验和迁移结果显示,Imatinib联合rapamycin显著抑制PASMC在体外增殖和迁移,且两者联合使用效果优于两者单独使用。Imatinib联合rapamycin使用显著抑制MCT-PH和Hyp/Sugen-PH的RVSP、右RV/(LV+S)、肺血管壁的增厚、肺血管的肌化程度以及PCNA在PASMC的阳性率。结果表明,imatinib联合rapamycin通过抑制肺血管重塑缓解MCT-PH和Hyp/Sugen-PH。基于以上结果,本研究得出,GALNT1和GALNT13介导的截短的O-Gal NAc的聚糖(Tn)通过调控PAEC的Endo MT进程调控PH的发展。GALNT1和GALNT13可作为治疗PH的潜在靶点。Imatinib作为抑制Tn水平的潜在靶向药物,其低剂量联合rapamycin使用是治疗实验动物PH的最佳策略。