苏云金芽胞杆菌YBT1520 WGS法拼接和蜡状芽胞杆菌群进化分类及16S rDNA分子指标分析

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本研究分为两部分,第一部分是用WGS法进行Bt YBT1520的全基因组测序工作。具体流程是包括:第一,构建好的文库进行末端测序,用phred程序将色谱图文件转变为phd格式的数值信号文件,phd2fasta将phd文件转变为fasta文件。第二,用phrap程序将末端测序read的fasta文件拼接成一系列的contig。第三,通过contig间的关系设计测序引物,填补空洞(gap—filling)。在观测大规模测序的read,发现许多特异的contig1)高拷贝小质粒和染色体组测序的覆盖度相差竟达到10倍。;2)该基因组上rDNA,Cry,IS,Tn等在基因组的不同位置有多个拷贝,同源序列长度大于read测序的最大值范围500—700bp。这就使得计算机无法将相关的read组装成与基因组排列相同的contig,造成了严重的错拼。填补空洞的过程分四个层次:1)洞数从2000—1400,主要的策略是增加测序量;2)1400—400,主要的策略是根据PUC read的正反向关系寻找contig的关系补洞;3)400—100,主要是依据BAC的和参考系列来测序寻找contig的关系补洞;4)100—8,主要是依据参考序列,fosmid文库,参考序列和端头随机扩增和测序的方法。模板的不同选择也影响着其效率。模板为高拷贝PUC18和PCR产物最好,pBeloBAC11次之,总基因组因为背景复杂所以效果不是很好。第二部分是对Bt YBT1520所在的Bc群分类进化分类分析,及具体指标16S rDNA的分析。对于具体分类指标16SrDNA,研究策略是以NCBI数据库中已有Bc群中的8株成了完成了基因组序列测定菌株。这8株蜡状芽胞杆菌群菌株98条16S rDNA的相互之间进行Blast比较,发现在同一基因组内各个16S rDNA拷贝全局相似度最低为99.27%,其中,在蜡状芽胞杆菌ATCC 10987基因组中,有一条16S rDNA很特殊,比其它的要长约50bp,不考虑这条序列该基因组16S rDNA全局相似度为99.73%,考虑这条序列则为96.47%。在不同基因组间16S rDNA局部片段比对最小相似度达到99.72%,对应片段长度也有1417bp。数据显示,该群的细菌完全共用同一种16S rDNA,根据16S rDNA给细菌分类的特点,它们应该属于同一个种(Species)。在亲缘关系上发现,枯草芽胞杆菌与蜡状芽胞杆菌群最近。而且进一步研究RNA操纵元发现:Bc群的细菌RNA操纵元数目在细菌中最高,反映了其强劲的生态适应能力。在空间位置上,RNA操纵元分布在复制起点两端,其中在负链5′—3′一端只有一个RNA操纵元,而正链5′—3′一端有许多RNA操纵元。负链5′—3′那端RNA操纵元富tRNA基因,
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