论文部分内容阅读
目的:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性炎症性疾病,以滑膜炎及伴随的进展性软骨和骨破坏为特征。其病因及发病机制尚不明确,未经治疗的类风湿关节炎的患者致残率较高,而骨破坏是RA致残的关键原因。目前证实对RA骨质破坏具有控制作用的治疗药物是以肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)拮抗剂为代表的缓解疾病的抗风湿性药物(Disease modifying antirheumatic drug,DMARDs),但该类药物的有效性有限,且毒副作用明显、价格昂贵。我们在复制胶原诱导关节炎/佐剂性关节炎(collagen-induced arthritis /adjuvant arthritis,CIA/AA)模型及成纤维样滑膜细胞培养等研究平台的基础上,观察了中药有效成分及其配伍(包括雷公藤多苷、雷公藤甲素、人参皂苷)对实验性关节炎及巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)表达的影响;开展了大鼠成纤维样滑膜细胞增殖及滑膜细胞MIF表达的血清药理学观察;进行了胶原诱导关节炎大鼠血清IL-1β、TNF-α与MIF表达的相关性分析及雷公藤有效成分的干预研究。本研究拟通过复制AA模型,探索MIF与骨破坏的相关性,以及中药有效成分配伍和中药有效成分与甲氨蝶呤(methotrexat,MTX)配伍的干预作用,为临床中药有效成分配伍治疗RA的骨破坏提供实验依据。方法:选择体重180g±20g的Wistar大鼠,雌雄各半。测量双侧足爪厚度后,用电子称测各组大鼠体重,随机分为正常对照组和AA组。正常对照组8只大鼠右后足跖部常规消毒,皮内注射注入0.1ml生理盐水;其余大鼠用同样的方法注射完全弗氏佐剂(0.1ml/只,卡介菌浓度10mg/ml),复制AA大鼠模型。造模后第21天将出现二次反应(arthritis index,AI≥5)的大鼠随机分为模型组、MTX组、雷公藤多苷组(tripterygium glycoside,TG)、人参皂苷组(ginsenoside,GS)、GS+MTX组、TG+GS组,每组8只。正常对照组和模型组给予生理盐水灌胃,其他组分别给予MTX、TG、GS、TG+GS、MTX+GS灌胃治疗,共21天。造模后第42d测量各组大鼠足爪厚度、体重;然后10%水合氯醛腹腔麻醉,腹主动脉取血留取血清。采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测模型鼠血清MIF和细胞核因子-κB受体活化因子RANK配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG);放射免疫法检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白介素-1(Interleukin-1,IL-1)水平。同时取双侧踝关节,经固定、脱钙、常规梯度脱水、浸蜡、包埋、切片。HE染色后光镜下观察组织切片病理改变;免疫组化法检测踝关节滑膜组织MIF与骨组织中RANKL、OPG的表达并进行半定量分析。统计学处理:所得数据均采用SPSS 13.0软件包进行统计学处理,所得结果以均数±标准差(±s)表示。各组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),采用LSD法进行组间两两比较。相关性分析采用Pearson相关检验。均以P<0.05认为有统计学意义。结果:1 TG+GS对各组大鼠一般情况的观察比较造模前各组体重差异无统计学意义(P>0.05)。造模后第21天,与正常对照组(23.38±4.44)相比,模型组(11.63±1.69)、MTX组(11.25±2.92)、TG组(11.38±3.85)、GS组(11.75±2.82)、GS+MTX组(13.13±4.32)、TG+GS组(13.75±2.87)体重增加值差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,MTX组、TG组、GS组、GS +MTX组、TG+GS组体重增加值差异无统计学意义(P>0.05)。造模后第42天,与模型组(6.12±2.53)相比,MTX组(8.87±4.64)和TG组(8.87±2.90)体重增加值差异无统计学意义(P>0.05),GS组(11.75±7.46)、GS+MTX组(16.25±3.69)、TG+GS组(20.00±7.09)体重增加值差异有统计学意义(P<0.05)。TG+GS组体重增加值最大。2 TG+GS对大鼠关节炎指数(AI)的变化造模后第21天,与模型组(10.00±1.69)相比,MTX组(9.63±1.41)、TG组(8.75±1.28)、GS组(10.13±1.73)、GS+MTX组(9.00±1.31)、TG+GS组(9.13±1.46)AI值差异无统计学意义(P>0.05)。造模后第42d,与模型组(2.38±0.52)相比,MTX组(5.13±1.46)、TG组(4.38±1.51)、GS组(4.13±1.36)、GS+MTX组(4.25±1.75)、TG+GS组(4.37±1.85)AI变化值差异有统计学意义(P<0.05)。MTX组最大,但TG+GS组与MTX组AI变化值差异无统计学意义(P>0.05)。3 TG+GS对AA大鼠双足爪肿胀抑制率的影响造模后第21天,与模型组(80.84±10.99,58.45±14.88)相比,TG组(79.00±9.77,59.95±15.66)、GS组(82.24±12.72,57.78±16.18)、MTX组(81.25±11.00,59.84±15.84)、GS +MTX组(81.27±11.43,57.85±16.02)、TG+GS组(83.82±13.81,59.66±15.76)双足爪肿胀率差异无统计学意义(P>0.05)。造模后第42天,MTX组双足平均肿胀抑制率为29.2%,TG组12.5%,GS组4.9%;GS +MTX组33.4%;TG+GS 29.6%。4 TG+GS对AA大鼠血清TNF-α、IL-1β、MIF、OPG、RANKL的影响4.1血清TNF-α(ng/ml)水平比较与正常对照组(0.87±0.11)相比,模型组(1.37±0.16)、MTX组(1.15±0.15)、TG组(1.17±0.17)、GS组(1.19±0.17)TNF-α水平差异有统计学意义(P<0.01),GS+MTX组(0.98±0.14)、TG+GS组(1.02±0.15)差异无统计学意义(P>0.05)。4.2血清IL-1β(ng/ml)水平比较与正常对照组(0.59±0.02)相比,模型组(0.18±0.03)、MTX组(0.16±0.02)、TG组(0.15±0.02)、GS组(0.16±0.03)、GS+MTX组(0.13±0.02)和TG+GS组(0.13±0.03)IL-1β水平差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,MTX组、TG组、GS+MTX组、TG+GS组IL-1β水平差异有统计学意义(P<0.05)。GS+MTX组和TG+GS组IL-1β水平最低。4.3血清MIF(pg/ml)水平比较与正常对照组(349.54±16.94)相比,模型组(453.99±53.53)、MTX组(417.73±38.90)、TG组(431.49±41.08)、GS组(423.89±45.01)、GS+MTX组(408.28±33.82)、TG+GS组MIF水平(411.59±41.58)差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,MTX组、GS+MTX组、TG+GS组差异有统计学意义(P<0.05),TG组、GS组差异无统计学意义(P>0.05)。GS+MTX组MIF水平最低,但TG+GS组与GS+MTX组差异无统计学意义(P>0.05)。4.4血清OPG(ng/ml)水平比较与正常对照组(69.41±3.36)相比,模型组(86.40±12.27)、TG组(79.14±8.90)、GS组(80.73±9.44)OPG水平差异有统计学意义(P<0.05),MTX组(74.80±6.80)、GS+MTX组(75.75±6.65)、TG+GS组(76.01±7.67)差异无统计学意义(P>0.05)。4.5血清RANKL(pg/ml)水平比较与正常对照组(21.25±1.57)相比,模型组(33.80±2.48)、MTX(27.13±2.74)、TG组(27.90±2.75)、GS组(28.11±2.89)、TG+GS组(24.55±2.10)RANKL水平差异有统计学意义(P<0.05),GS+MTX组(23.88±2.20)差异无统计学意义(P>0.05)。GS+MTX组RANKL水平最低,但TG+GS组与GS+MTX组差异无统计学意义(P>0.05)。4.6血清RANKL/OPG比值比较与正常对照组(0.28±0.06)相比,模型组(0.40±0.06)、MTX组(0.34±0.04)、TG组(0.36±0.05)、GS组(0.35±0.07)RANKL/OPG比值差异有统计学意义(P<0.05),GS+MTX组(0.32±0.06)、TG+GS组(0.32±0.02)差异无统计学意义(P>0.05)。4.7血清MIF水平与TNF-α、IL-1β、RANKL比值和关节炎病理积分的相关性MIF与TNF-α、IL-1β、RANKL、病理积分存在正相关关系(r =0.938,0.748,0.763,0.908,P<0.05)。5 TG+GS对AA大鼠踝关节病理变化的影响病理结果显示,正常对照组大鼠踝关节未见明显病变。模型组大鼠滑膜细胞增生,滑膜组织炎细胞浸润,滑膜衬里层增厚;滑膜与软骨连接区域滑膜细胞增生,软骨有损伤;骨小梁变细,软骨下骨和小梁骨出现骨侵蚀,破坏严重,甚至观察不到完整的骨小梁结构。各用药组病理改变较模型组减轻。与模型组(2.00±1.07)相比,GS+MTX组(0.88±0.83)病理积分差异有统计学意义(P<0.05),MTX组(1.88±1.07)、TG组(1.63±1.19)和GS组(1.88±0.99)、TG+GS(1.38±1.19)差异无统计学意义(P>0.05)。6 TG+GS对AA大鼠踝关节骨组织中OPG、RANKL和滑膜组织中MIF表达的影响与正常对照组(0.07±0.03)相比,模型组(0.19±0.07)、TG组(0.15±0.07)、GS组(0.16±0.05)、TG+GS组(0.13±0.06)关节骨组织中OPG表达差异有统计学意义(P<0.05),MTX组(0.11±0.07)、GS+MTX组(0.12±0.06)差异无统计学意义(P>0.05)。MTX组OPG表达最少,但TG+GS组与MTX组差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组(0.08±0.03)相比,模型组(0.28±0.08)、TG组(0.19±0.10)、GS组(0.21±0.07)踝关节骨组织中RANKL表达差异有统计学意义(P<0.05),MTX组(0.13±0.08)、GS+MTX组(0.14±0.08)、TG+GS组(0.15±0.07)差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组(0.07±0.03)相比,模型组(0.30±0.06)、MTX组(0.21±0.07)、TG组(0.25±0.10)、GS组(0.22±0.08)、GS+MTX组(0.19±0.08)、TG+GS组(0.21±0.08)滑膜组织中MIF表达差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,MTX组、GS+MTX组、TG+GS组差异有统计学意义(P<0.05),TG组和GS组差异无统计学意义(P>0.05);MTX组、GS+MTX组和TG+GS组滑膜组织中MIF表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1血清MIF水平与TNF-α、IL-1β、RANKL、关节炎病理积分水平存在正相关关系,MIF上调TNF-α、IL-1β、RANKL的水平及加重骨破坏的病理变化,可能是其参与类风湿关节炎骨破坏的重要机制。2雷公藤多苷联合人参皂苷可能通过降低血清TNF-α、IL-1β、MIF、RANKL、OPG的水平和RANKL/OPG的比值,减少滑膜组织中MIF及关节骨组织中OPG、RANKL的表达,而对AA大鼠具有骨保护作用。3雷公藤多苷联合人参皂苷在拮抗MIF和降低RANKL/OPG比值方面的作用,进一步证实了它们在抗炎、骨保护方面的调控作用,从而为RA的治疗提供了新思路、新方法。