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【背景与目的】艾滋病在世界范围内的迅猛传播严重威胁着人类健康、生存和社会发展。由于该病流行面广,危害性大,因此其传播途径的研究一直是各国政府和科学家们高度重视的课题。目前已知HIV的传播途径有,①性传播;②血液传播;③母婴垂直传播。1998年Alexander等提出“艾滋病毒有可能通过生殖细胞垂直传播”的假设。但由于没有合适的动物模型和细胞培养系统,10多年过去了没有人能证实这个假说。理论上,用艾滋病患者的精子与正常人卵母细胞受精,研究从精子、受精到胚胎发育各阶段中HIV-1基因的行为是最理想的途径,但这条途径既存在法律、伦理问题,也存在获取人卵母细胞的困难。本研究成功地构建了重组质粒pIRES2-EGFP-gag,将其转染人精子,与金黄地鼠去透明带卵母细胞受精后,检测HIV-1 gag基因在人精子染色体上的整合与在早期胚胎细胞中的复制和表达,为HIV-1基因能否在父婴间垂直传递提供直接的实验证据。【材料与方法】⒈材料:⑴pIRES2-EGFP质粒;⑵ΔNRF逆转率病毒质粒;⑶人脐带间充质干细胞;⑷精子,取自健康男性自愿者;⑸卵母细胞,取自成熟雌性金黄地鼠。⒉方法:⑴pIRES2-EGFP-gag质粒构建,用酶切、PCR和基因测序3种方法鉴定重组质粒是否构建成功;⑵细胞培养及转染,观察绿色荧光蛋白的表达,检测pIRES2-EGFP-gag质粒能否在真核细胞中表达;⑶人精子与金黄地鼠去透明带卵母细胞异种体外受精,获取受精卵和2-细胞胚胎;⑷荧光原位杂交(FISH),检测HIV-1 gag基因是否在人精子、受精卵雄原核上整合及在胚胎细胞中复制;⑸RT-PCR,检测HIV-1 gag基因是否在人精子、胚胎细胞中转录;⑹免疫荧光技术,检测HIV-1 gag基因是否在人精子、胚胎细胞中翻译。【结果】⑴质粒经EcoRI和BamHI分别单酶切及EcoRI和BamHI双酶切,PCR和测序证实pIRES2-EGFP-gag质粒构建成功;⑵质粒经脂质体包裹后转染人脐带间充质干细胞,可见绿色荧光蛋白持续表达,表明构建的pIRES2-EGFP-gag质粒能在真核细胞中表达;⑶人精子与金黄地鼠去透明带卵母细胞异种体外受精,成功地获取了用于实验的受精卵和2-细胞胚胎;⑷FISH:在人精子头部、人精子染色体,受精卵雄原核和2-细胞胚两个间期核上均观察到HIV-1 gag DNA阳性杂交信号;⑸RT-PCR:在经pIRES2-EGFP-gag转染的人精子及其与金黄地鼠去透明带卵母细胞受精后所得的胚胎样本中,观察到HIV-1 gag基因阳性带;⑹免疫荧光检测:在经pIRES2-EGFP-gag转染的人精子样本中未观察到HIV-1 gag p24蛋白的阳性信号,但在其与金黄地鼠去透明带卵母细胞受精后所得的胚胎样本中,观察到HIV-1 gag p24蛋白的阳性信号。【结论】⑴成功地构建了重组质粒pIRES2-EGFP-gag;⑵pIRES2-EGFP-gag质粒可以在真核细胞中表达;⑶HIV-1 gag基因能通过精子膜进入精子细胞并能整合到精子基因组内;⑷携带HIV-1 gag基因的人精子可以完成正常受精过程;⑸精子介导的HIV-1 gag基因在早期细胞中与宿主基因组同步复制并通过卵裂进入子细胞;⑹HIV-1 gag基因可在人精子和胚胎细胞中转录;⑺由人精子带入受精卵的HIV-1 gag基因可在胚胎细胞中表达HIV-1 gag p24蛋白,但在精子细胞中不能表达;⑻本研究为HIV-1 gag基因通过精子在父婴间垂直传递提供了直接的实验证据。