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增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)是局限于皮肤伤区范围之内的纤维组织过度增生,常见于深Ⅱ度、Ⅲ度皮肤烧伤创面。成纤维细胞(fibroblast,Fb)的异常增殖及胶原(collagen)合成增加和过度沉积是增生性瘢痕的病理特征。目前对其发病机制仍不清楚,一般认为胶原合成的主要细胞-成纤维细胞的功能异常与其自分泌的某些因子、蛋白关系密切。如由增生性瘢痕成纤维细胞自分泌的转化生长因子-α、β(transforming growth factor-α、β,TGF-a、β)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGF-binding proteins,IGFBPs)的调控模式不同于正常皮肤,由此影响了增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成。P物质(substance P,SP)是目前发现最早、功能复杂的神经肽,它不仅存在于中枢、外周神经系统,成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞(单核/巨噬细胞、肥大细胞)等不仅有P物质受体,还可合成、分泌P物质。成纤维细胞自分泌SP受胞外SP的调控。如以大剂量辣椒素耗竭感觉神经末梢,阻断神经末梢释放SP后,致伤鼠皮肤伤区肉芽组织成纤维细胞SP表达较未用辣椒素致伤鼠明显减弱;10-8mol/L SP加入正常皮肤成纤维细胞的培养液后1-3h,成纤维细胞的SP基因和蛋白表达迅速上调。近来的研究证实,SP是组织修复的重要调控因子。皮肤损伤时感觉神经末梢释放的SP不仅可启动神经源性炎性反应,同时可诱导成纤维细胞内多种细胞因子(如TGF-β、EGF、TNF)表达增多,直接或间接促进成纤维细胞增殖。已知增生性瘢痕组织中SP含量明显较正常皮肤组织高,但目前尚不明确增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar fibroblast,HSF)SP表达水平与正常皮肤成纤维细胞(normal skin fibroblast,NSF)相比有何特点,细胞外SP对其表达有何影响,SP在增生性瘢痕胶原合成中有何作用?针对上述问题开展研究,无疑将丰富增生性瘢痕成纤维细胞异质性理论,同时可以为增生性瘢痕治疗提供新的思路。为探讨增生性瘢痕成纤维细胞SP表达的特点及其对胶原合成的影响,本研究采用体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞为对象,以培养的正常皮肤成纤维细胞为对照,利用RT-PCR和酶联免疫吸附检测(ELISA)技术,分别从mRNA和蛋白两个水平检测增生性瘢痕成纤维细胞SP的表达。在此基础上,分别用10-7mol/L(低浓度)和10-5mol/L(高浓度)SP以模拟不同胞外SP浓度刺激培养的增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞,观察两种成纤维细胞SP表达的时效特点,以此分析细胞外SP对增生性瘢痕成纤维细胞SP表达的影响。为了解成纤维细胞自分泌SP在胶原合成中的作用,以SP受体阻断剂(WIN62577)特异阻断培养的增生性瘢痕成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞SP受体NK-1R(Neurokinin 1 receptor)后,采用放射示踪法检测3H-脯氨酸掺入及免疫细胞化学结合图像分析技术,分析NK-1R阻断后成纤维细胞胶原合成的变化。结果如下:1、体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞的鉴定及SP表达情况(1)体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞呈长梭形,波形蛋白(+),α-平滑肌肌动蛋白(-),确定为实验所需的成纤维细胞。(2)体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞内SP mRNA表达明显高于正常皮肤成纤维细胞,其SP蛋白表达量为0.132±0.026nmol/L,而正常皮肤成纤维细胞SP蛋白表达量为0.056±0.022nmol/L,两者之间差异显著(P<0.05)。2、外源性SP对增生性瘢痕成纤维细胞SP表达的影响采用不同浓度的SP刺激体外培养的增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞后,发现成纤维细胞SP mRNA和蛋白表达均明显上调,但增生性瘢痕成纤维细胞在达到峰值的时相、升高的幅度、峰值均明显不同于正常皮肤。(1)成纤维细胞SP mRNA表达10-7mol/L SP刺激后,增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞SP mRNA表达受SP刺激后均出现上调,分别在刺激后6h、3h达到高峰,随后缓慢下降。10-5mol/L SP刺激后,增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞内SP mRNA在刺激后3h、6h达到高峰,增生性瘢痕成纤维细胞峰值高于正常皮肤。两种浓度刺激后24h增生性瘢痕成纤维细胞SP mRNA均高于正常皮肤成纤维细胞。(2)成纤维细胞SP蛋白表达10-7mol/L SP刺激后,增生性瘢痕成纤维细胞SP蛋白表达在刺激后6h达到高峰,达到0.367±0.026nmol/L,升高了225%,随后缓慢下降,刺激后24h为0.224±0.014nmol/L,仍高于未刺激瘢痕成纤维细胞,两组相差非常显著(P<0.01)。正常皮肤成纤维细胞SP蛋白表达在刺激后3h达到高峰,达到0.489±0.022nmol/L,升高了823%,刺激后24h为0.163±0.015 nmol/L,高于未刺激正常皮肤成纤维细胞(P<0.01)。10-5mol/L SP刺激后,增生性瘢痕成纤维细胞SP蛋白在刺激后3h达到高峰,达到1.476±0.068nmol/L,较刺激前升高了834%,随后迅速下降,刺激后24h为0.248±0.031 nmol/L,仍高于未刺激瘢痕成纤维细胞(P<0.01)。10-5mol/L SP刺激后,正常皮肤成纤维细胞SP蛋白在刺激后6h达到高峰,达到1.257±0.086nmol/L,升高了1805%,刺激后24h为0.196±0.024 nmol/L,高于未刺激正常皮肤成纤维细胞(P<0.01)。(3)与正常皮肤成纤维细胞相比,10-7mol/L或10-5mol/L SP刺激下增生性瘢痕成纤维细胞SP mRNA和蛋白表达的峰值、达到峰值时相均有明显差异(P<0.05或P<0.01),且刺激后24h增生性瘢痕成纤维细胞SP表达水平均高于正常皮肤成纤维细胞。3、SP对增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响。(1)增生性瘢痕成纤维细胞3H-脯氨酸掺入闪烁点计数为82.13±9.23 cpm/1000细胞,显著高于正常皮肤成纤维细胞(35.7±9.8 cpm/1000细胞)(P<0.01)。加入NK-1R阻断剂后,增生性瘢痕成纤维细胞3H-脯氨酸掺入闪烁点计数为36.75±5.83cpm/1000细胞,明显低于未阻断的对照组,阻断率达到55.25%,组间差异非常显著(P<0.01)。正常皮肤成纤维细胞NK-1R阻断后,3H-脯氨酸掺入闪烁点计数为24.48±3.48cpm/1000细胞,低于未阻断的对照组(35.7±9.8 cpm/1000细胞),阻断率为31.43%,组间差异非常显著(P<0.01)。(2)加入NK-1R阻断剂后,免疫组化半定量分析结果示,Ⅰ型前胶原的平均灰度值为102.18±15.26,Ⅲ型前胶原的平均灰度值为111.53±14.79,均明显低于未阻断对照组(P<0.01),阻断率分别为33.35%、21.67%。结论:1、增生性瘢痕成纤维细胞SP mRNA和蛋白表达均明显高于正常皮肤成纤维细胞,这可能是增生性瘢痕组织中SP含量高的原因之一。2、外源性SP对增生性瘢痕成纤维细胞P物质表达的影响不同于正常皮肤成纤维细胞。10-7mol/L或10-5mol/L SP作用于增生性瘢痕成纤维细胞,其SP基因、蛋白表达升高时相点、峰值均与正常皮肤成纤维细胞有显著差异,且刺激后24h增生性瘢痕成纤维细胞SP表达水平均高于正常皮肤成纤维细胞。表明增生性瘢痕成纤维细胞功能异质性明显,其SP基因、蛋白表达与正常皮肤成纤维细胞有明显差异。SP自分泌的“调控平衡点”上调,可能是增生性瘢痕成纤维细胞SP表达水平高的原因之一。3、SP是促进成纤维细胞胶原合成的重要因子。增生性瘢痕成纤维细胞高表达SP是成纤维细胞脯氨酸摄入增多,胶原合成增加的重要因素。