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生物分子的识别与相互作用是众多生命现象的基础,是生命科学和化学生物学研究中的一个热点和前沿问题。本论文围绕生物分子的识别作用,开展了一系列基础与应用研究,包括正义肽一反义肽特异性相互作用研究、基于反义肽的石英晶体微天平(QCM)免疫传感器测定人β干扰素、以及粘胶人造丝作为一种新型亲和色谱基质的研究等三方面工作。
正义肽与反义肽是一类特殊的相互作用体系。迄今为止,大量的研究证实由编码DNA链翻译产生的正义肽与根据非编码DNA链人工合成的反义肽之间存在一定的选择性和亲和力,但这种相互作用的机理和规律尚有待进一步阐明。本论文以高效亲和色谱及QCM生物传感器为手段,针对反义肽的简并性开展了进一步研究。选用人β干扰素结构中1-14位氨基酸组成的肽链作为正义肽,以亮氨酸及其三个简并氨基酸,谷氨酰胺、谷氨酸和赖氨酸为模型氨基酸,设计合成了三条反义肽(AS-IFN1、AS-IFN2和AS-IFN3)。分别建立了基于正义肽的高效亲和色谱体系及QCM体系,研究了正、反义肽之间的相互作用,对正、反义肽识别的动力学过程进行了分析,并探讨了正、反义肽识别的作用机理。结果显示:三条反义肽与相对应的正义肽之间的作用力存在着较大的差异,其平衡解离常数分别为:2.08×10-4 mol/L(AS-IFN1)、1.31×10-4 mol/L(AS-IFN2)、及2.21×10-5 mol/L(AS-IFN3);谷氨酸取代的反义肽AS-IFN3在pH7.5条件下表现出最强的亲和相互作用。机理研究证实,该作用不是以疏水模式、体积排阻模式或离子交换模式等单一模式进行的,而是正、反义肽之间分子识别的结果。
提出并构建了一种基于反义肽的新型QCM免疫传感器用于重组人β干扰素的检测,并进一步探讨了反义肽简并性用于提高反义肽亲和作用力的可行性。在前一章工作的基础上,选择针对人β干扰素结构中1-14位氨基酸序列的反义肽AS-IFN1和AS-IFN3作为识别元件,分别构建了两个QCM免疫传感器,检测了重组人β干扰素在这两个传感器上的动态结合过程并测定了相关的动力学常数。结果表明:基于反义肽制备的QCM免疫传感器表现出了良好的选择性:重组人β干扰素在传感器上均显示出明显的结合,并且与AS-IFN1和AS-IFN3两条反义肽之间的作用力存在差异,其平衡解离常数分别为(1.89±0.101)×1O-4 mol/L及(1.22±0.0479)×10-5 mol/L,说明经简并氨基酸取代的反义肽AS-IFN3与目标蛋白的结合力增强,是原始反义肽AS-IFN1的15.5倍,更加有利于作为QCM免疫传感器的识别元件以检测重组人β干扰素。由于克服了传统的免疫传感器抗原或抗体分子制备困难、使用寿命较短、易失活、价格昂贵等缺点,基于反义肽构建的QCM免疫传感器具有广阔的应用前景。
纤维素作为一种生物相容性好、价廉易得的生物大分子早已在色谱技术中得到了广泛的应用。但由于结构中存在结晶区与非结晶区,在作为亲和吸附剂使用时,配基的偶联在微观上将呈现不均一性,对吸附容量和大分子的吸附及洗脱均会产生不利影响。此外,由于它易受压缩,且柱床稳定性较差,因而不能用于高流速下的淋洗。粘胶人造丝是一种价廉易得的再生纤维素,再生后的纤维素由于破坏了结构中的结晶区,使其结构中能参加反应的羟基数目增多,既有利于与亲和配基的偶联,也有助于保持优良的生物相容性。采用粘胶人造丝为基质,以肝素为模型配基,以抗凝血酶III和人血浆为样品,制备了一种新型的高效亲和色谱填料,以考察粘胶人造丝作为高效亲和色谱基质的可能性。结果表明:粘胶人造丝不仅具有很好的机械性能,可在高流速(1500cm/h)、高压条件(14 MPa)下使用;同时具有很好的生物相容性和化学稳定性,对抗凝血酶III的回收率为90%;并能实现人血浆中AT III的一步纯化,所纯化的AT III的纯度可达93%。由此提示,粘胶人造丝是一种极有应用前景的生化分离基质材料。