子痫前期（preeclampsia,PE）的定义为产妇妊娠20周后新出现的高血压和蛋白尿,目前在世界范围内的发病率为5%-8%[1],可并发胎盘早剥、早产及胎儿宫内生长受限等,是导致孕产妇和围生儿死亡的主要原因之一[2]。子痫前期发病率受到多种因素影响,包括营养、种族、地理位置等。许多学者提出子痫前期的发病机制,包括母胎界面免疫失衡[3]、氧化应激[4]、胎盘形成不良[5]以及遗传易感性[6]等。目前子痫前期的病因尚未完全明确,Redman于2009年提出的“两阶段”学说仍为大众学者接受[7]。第一阶段在早期妊娠时滋养细胞的过度的母体免疫反应,以及蜕膜化不足或子宫准备失败导致螺旋动脉重塑障碍,血管末端扩张不足,流经胎盘血液流速下降不明显,子宫胎盘血流减少导致胎盘灌注不良,进而影响胎盘功能。第二阶段,胎盘灌注不良造成的缺氧和复氧导致胎盘功能进一步紊乱和胎盘氧化应激状态。随后滋养细胞凋亡及坏死,全身炎症反应因子向母体循环释放。过多的全身性炎症反应造成血管过度激活及血管内皮损伤,随后母体多系统的多器官血流灌注减少,进而产生一系列临床症状。因此,子痫前期是一个两个基因来源不同的独立器官之间相互作用受损的疾病。目前为止针对子痫前期的病因和发病机制有大量研究,但是学者们仍未得到令人满意的理论学说。长链非编码RNAs（long non-coding RNAs,LncRNAs）是一系列广泛转录自人及其他哺乳动物基因组上长度超过200nt的RNA分子,由Okazaki于2002年从小鼠的DNA转录本中首次发现,它们本身不编码蛋白质,主要通过转录及转录后水平、表观遗传学调控基因的表达,参与疾病的生物学功能。根据其在基因组中相对蛋白编码基因的位置,可以分为基因间RNA,反义转录本,内含子,启动子相关的长链非编码RNA等。已经报道的长链非编码RNA可以对基因表达各个步骤产生影响,包括染色体失活,基因印记,表观遗传调控,核浆运输,转录调控,m RNA剪切和翻译。在细胞水平,lncRNA参与了细胞增殖、分化、细胞周期、凋亡及自噬。虽然lncRNA研究进展迅速,但是lncRNA的作用机制的认识仍旧有限,特别是这些RNA是如何靶向调控其他RNA的。一些研究表明,LncRNA可以通过召集染色体重构复合体到特定的基因位点进行表观遗传调控;还有lncRNA可以参与转录过程,其中一部分lncRNA作为反义转录本调节m RNA动态平衡;此外,许多lncRNA可以产生小RNA,进而调控他们的靶向分子。近年来对于lncRNA表达异常及他们如何参与子痫前期发生发展已经有很多研究。He等人采用lncRNA基因芯片检测的子痫前期患者和正常孕妇胎盘组织中的差异基因,共发现了738个差异表达的lncRNA,提示表达异常的lncRNA可能参与了子痫前期的发生发展。我们前期研究中,通过DNA微阵列技术检测了子痫前期患者和正常妊娠胎盘组织中的基因表达差异,结果显示X染色体失活特异性转录本（X inactive specific transcript,XIST）在子痫前期患者胎盘滋养细胞中表达下调,但是我们仍不明确XIST在胎盘滋养细胞中的定位和子痫前期患者胎盘当中的定量。miRNA是一种非编码RNA序列,通常包含18-24个核苷酸。活性RNA诱导沉默复合物（RISC）可以由成熟的miRNA能够与其他相关蛋白结合形成,从而参与下游靶基因的调控。已经有很多研究发现miRNA参与了子痫前期的发病。在正常妊娠过程中,滋养细胞表现为能够穿过上皮基底膜向子宫螺旋小动脉迁移,进而侵袭血管内皮对其进行重构,深度可达子宫内膜的内三分之一,这一行为与肿瘤细胞的转移侵袭的行为类似。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是指上皮细胞向间充质细胞的转化,其特征是上皮细胞极性丧失成纺锤形,细胞骨架重建,上皮细胞标志物（如细胞角蛋白和E-钙粘蛋白）的丢失,间质细胞标记物（如波形蛋白和钙粘蛋白）的表达。当肿瘤细胞侵袭转移时,E-钙粘蛋白表达的下调削弱了细胞间的粘附,使肿瘤细胞容易从肿瘤体内脱落和转移。在妊娠早期,位于子宫蜕膜绒毛柱顶端的细胞滋养细胞向绒毛外滋养细胞分化时,经历了EMT过程,伴随着细胞类型的改变,绒毛外滋养细胞获得了更大的侵袭性,使得子宫螺旋动脉得以重构,建立子宫胎盘血液循环,确保发育中的胎儿获得充足的营养和气体供应。EMT过程的异常将导致绒毛外滋养细胞侵袭力的异常,最终导致许多妊娠相关疾病的发生,包括子痫前期,胎儿宫内生长受限,复发性流产等。本研究的目的是探讨lncRNA XIST是否在PE发病中发挥作用,其对滋养细胞的增殖、迁移、侵袭功能进行调控,与miRNA结合进而负性调控靶蛋白从而参与滋养细胞EMT过程。本研究针对以上问题,探究lncRNA XIST及下游基因影响滋养细胞生物学行为的可能的分子机制。方法一、XIST在子痫前期胎盘滋养细胞中的表达差异及其对滋养细胞的功能的影响收集2016年9月-2017年6月在中国医科大学附属第一医院产科分娩的子痫前期患者胎盘15例,同期妊娠健康孕妇患者15例为正常对照组。本研究经中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准,所有研究对象均签署知情同意书,孕妇在孕周、年龄、身高、体重等一般条件匹配,月经规则,本次妊娠经过正常,无任何合并症和并发症（子痫前期除外）,既往无不良妊娠史,无原发性高血压、糖尿病、肾病、癌症等病史,无嗜烟、嗜酒等不良生活习惯。应用Real-time PCR检测胎盘中XIST m RNA表达。设计合成XIST的si RNA,采用人绒毛膜滋养细胞系HTR8/SVneo,应用Ed U法检测转染及感染后滋养细胞HTR-8/SVneo的增殖情况;应用transwell法检测转染及感染后滋养细胞HTR-8/SVneo迁移和侵袭能力的改变。原位免疫荧光杂交方法明确XIST在患者胎盘中定位。二、lncRNA XIST与miR-135b-5p结合,miR-135b-5p对滋养细胞功能的影响应用DIANA软件预测分析发现XIST存在miR-135b的结合位点。应用Real-time PCR检测胎盘中miR-135b-5p表达。双荧光素酶报告基因级RIP实验分析XIST与miR-135b-5p的靶向结合作用及结合位点。设计合成miR-135b的抑制剂,采用人绒毛膜滋养细胞系HTR8/SVneo,应用Ed U法检测不同干预条件下滋养细胞HTR-8/SVneo的增殖情况;应用transwell法检测转染后滋养细胞HTR-8/SVneo侵袭能力的改变。三、miR-135b-5p与靶基因FOXO1结合,FOXO1对滋养细胞功能的影响应用Target Scan软件预测分析发现,在FOXO1的3’-UTR区存在miR-135b-5p的结合位点。应用Western blot及Real-time PCR法,检测XIST在子痫前期胎盘中蛋白和m RNA的定量表达。应用Ed U法检测不同干预条件下滋养细胞HTR-8/SVneo的增殖情况;应用transwell法检测转染后滋养细胞HTR-8/SVneo迁移和侵袭能力的改变。Western blot检测滋养细胞HTR-8/SVneo转染FOXO1上调质粒后,细胞中E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、β-钙黏素及波形蛋白改变,检测FOXO1对滋养细胞EMT的影响。第一部分:Real-time PCR检测结果XIST在子痫前期胎盘组织于m RNA的表达水平下调,其差异具有统计学意义。应用Ed U细胞增殖检测法,检测XIST对滋养细胞HTR-8/SVneo增殖能力的影响,发现滋养细胞HTR-8/SVneo被干扰质粒转染后滋养细胞HTR-8/SVneo增殖能力明显降低。应用transwell法,检测XIST对滋养细胞HTR-8/SVneo迁移和侵袭能力的影响,发现滋养细胞HTR-8/SVneo被XIST干扰质粒转染后侵袭能力显著降低。原位免疫荧光杂交检测到XIST在人胎盘滋养细胞的胞浆中大量表达,其可能与胞浆中分子相互作用进而影响滋养细胞生物学行为。第二部分:Real-time PCR检测发现miR-135b在子痫前期胎盘组织m RNA表达水平明显高于正常胎盘组织,其差异具有统计学意义。应用Ed U细胞增殖检测、transwell细胞侵袭检测发现miR-135b对滋养细胞HTR8/SVneo具有增强增殖和侵袭能力的作用。而抑制miR-135b则结果正好相反。双荧光素酶报告基因检测发现XIST可以与miR-135b在特定位点相互结合。RIP实验证实长链非编码RNA XIST与miR-135b存在于相同的RISC复合体。采用共转染方法检测miR-135b可以下调因XIST上调所带来的滋养细胞增殖及侵袭能力增强,提示XIST可能通过miR-135b调控滋养细胞生物学功能。第三部分:western blot检测发现FOXO1蛋白在子痫前期胎盘组织表达水平明显高于正常胎盘组织,其差异具有统计学意义。应用Ed U细胞增殖检测、transwell细胞侵袭检测发现FOXO1对滋养细胞HTR8/SVneo具有增强增殖和侵袭能力的作用。而抑制FOXO1则结果正好相反。双荧光素酶报告基因检测发现miR-135b可以与FOXO1的3’UTR区结合,而转染miR-135b后滋养细胞当中FOXO1蛋白表达下调也证实了这一点。共转染XIST及FOXO1提示XIST可以通过FOXO1调控滋养细胞增殖和侵袭能力。进而共转染XIST及miR-135b检测细胞当中FOXO1蛋白表达,发现XIST可以通过miR-135b调控FOXO1蛋白表达水平。用FOXO1的过表达质粒转染滋养细胞HTR8/SVneo发现,EMT相关蛋白中,E-钙粘蛋白和β-钙黏素蛋白表达上调,而N-钙粘蛋白及波形蛋白表达下调,提示FOXO1可以在滋养细胞HTR8/SVneo中增强其EMT,从而增加侵袭作用。结论1、长链非编码RNA XIST在子痫前期胎盘中的表达明显降低,敲减XIST后滋养细胞HTR-8/SVneo的增殖和侵袭能力下降,凋亡增加及G2/S期细胞比例减少,XIST可能通过此途径影响滋养细胞HTR-8/SVneo的增殖能力。2、miR-135b在子痫前期胎盘中的表达明显高于正常妊娠胎盘,miR-135b对滋养细胞HTR-8/SVneo的增殖和侵袭能力具有抑制作用。XIST与miR-135b可以直接结合,XIST可以通过miR-135b调控滋养细胞HTR-8/SVneo的增殖和侵袭能力。3、FOXO1蛋白在子痫前期胎盘中的表达明显降低,FOXO1对滋养细胞HTR-8/SVneo的增殖和侵袭能力具有促进作用,其中侵袭作用的增强与EMT相关。miR-135b可以靶向结合FOXO1 3’UTR区域,XIST可以通过miR-135b/FOXO1调控滋养细胞HTR-8/SVneo的增殖和侵袭能力。