严重创伤不仅可以造成局部组织的损害和机能障碍，而且还可引起全身性炎症反应，在此过程中常常伴有感染的发生，适度的全身性炎症反应对机体具有重要的保护作用。一旦炎症反应失控，最终可导致多种严重并发症的发生，细胞因子网络在其中处于最重要的地位。革兰氏阴性细菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)能过度激活单核巨噬细胞系统NF-κB(nuclear factor-kappaB)炎性信号，导致大量炎性细胞因子(TNF，IL-1等)的活化表达，从而引起脓毒症休克，是细菌感染患者死亡的首要原因。以往的研究都集中在拮抗LPS和炎性细胞因子方面，但效果均不理想。而机体内源性保护机制对创伤感染及其并发症的发生、发展具有重要的影响。因此，深入研究机体内源性保护机制，探讨如何有效抑制NF-κB的活化，从而减少炎性细胞因子的产生来限制创伤后感染的进一步发展，已成为当前研究领域的重要课题。 近年在细胞内源性保护机制的研究中发现了一类新的蛋白质分子，即锌指蛋白A20(zinc finger protein A20)。研究证实：LPS或TNF等刺激因素均可诱导内源性锌指蛋白A20的快速表达，而A20对通过终止LPS或TNF诱导的NF-κB活化来限制炎症反应是很关键的，对NF-κB的活化具有重要的负反馈调控作用，是防止体内炎症反应失控的重要调节蛋白。A20研究的兴起，为深入揭示机体内源性保护机制以及进一步抑制创伤感染及其并发症的发生、发展提供了一条新的途径。 基于以上认识，为深入探讨创伤合并感染时锌指蛋白A20的表达变化及其抗炎作用，本实验制作了小鼠骨折创伤合并内毒素血症模型，运用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹、免疫组织化学、组织形态学观察、基因转染、凝胶迁移(EMSA)、酶联免疫吸附(ELISA)、血清酶生物化学分析等技术手段，首先对创伤及合并感染的情况下锌指蛋白A20在组织中的表达变化进行了系统的研究；然后探讨了在内毒素刺激的条件下，锌指蛋白A20在小鼠RAW264.7巨噬细胞中的表达规律；以脂质体介导锌指蛋白A20质粒成功转染小鼠RAW264.7巨噬细胞，并以内毒素刺激为诱导因素，系统探讨了锌指蛋白A20对NF-κB活性的调节作用以及对促炎细胞因子表达的影响；动物在体应用外源性锌指蛋白A20，初步探讨了A20对内毒素炎性损伤小鼠的保护作用。第三军医大学博士学位论文主要实验结果与结论: 1，单纯创伤组小鼠肝组织内各时相点锌指蛋白AZOmRNA和蛋白含量均呈现低量表达，与正常对照组相比无显著性差异;单纯注射内毒素后0.5h，AZOmRNA和蛋白含量均较对照组升高明显，内毒素注射后0.5一Zh为A20mRNA表达的高峰期，2h以后表达又有所下降，各时相点均高于单纯创伤组。而内毒素注射后0.5~7h AZO蛋白表达较单纯创伤组显著升高;相比之下，创伤并注射内毒素后0.5h，A20mRNA和蛋白含量均较其他两组升高显著，内毒素注射后0.5一Zh为A20mRNA表达的高峰期，显著高于单纯内毒素组，至4h、7h、10h时表达逐渐下降，但仍显著高于单纯创伤组;而内毒素注射后0.5~10h A20蛋白表达也较单纯内毒素组显著升高。提示锌指蛋白AZO的表达既存在内毒素依赖性，又具有明显的时效性，在内毒素刺激的早期即可达到高峰表达。并且在创伤和感染同时存在的条件下，锌指蛋白A20的表达较单纯感染和单纯创伤时显著增加。同时，在创伤合并内毒素血症的情况下，除肝组织以外，全身其他脏器如:肺、脾、肾、肠等组织中也存在一定程度锌指蛋白A20的表达。 2.小鼠RAW264.7巨噬细胞在内毒素刺激的情况下，锌指蛋白A20 mRNA随着内毒素刺激时间的改变而发生了显著的变化:正常情况下，锌指蛋白A20 mRNA呈现低量表达;在LPS刺激后0.5h，AZO mRNA表达较正常对照组有所增加;但在LPS刺激后lh，A20 mRNA表达显著升高，且呈峰值表达，与其他时相点相比具有显著性差异;lh后AZO mRNA表达呈现明显下降趋势。提示锌指蛋白A20的表达在RAW264.7细胞中也存在内毒素依赖性和明显的时效性，在内毒素刺激的早期即可达到高峰表达。 3.将外源性小鼠锌指蛋白A20质粒转染小鼠RAW264.7巨噬细胞，于内毒素刺激前后，核因子一KB的表达活性发生了明显的改变:转染前，NF一 KB活性强、TNFa含量高;而转染后，NF一KB活性明显减弱、TNFa含量显著降低，且与转染前相比差异显著。提示锌指蛋白AZO可能是一种重要的内源性抗炎保护蛋白，创伤感染时组织内AZO表达增加，可能对于调控创伤感染时适度的炎症反应具有重要作用。 4.创伤感染时，应用外源性锌指蛋白AZO前后，对实验动物肝组织病理学观察发现，对照组动物肝窦扩张，炎细胞浸润，肝小叶结构紊乱，并可见弥漫性肝细胞水肿、变性。血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和总胆红素(TB)含量升高。肝组织中TNF。含量增加。且实验动物24h死亡率较高(53.3%);而应用外源性A20组肝窦轻度扩张，少量炎细胞浸润，肝小叶结构基本完整，肝组织病理损害较对照组有所好转。血清ALT和TB含量、肝组织中TNF。含量及实验动物24h死亡率(26.7%)，较对照组降低显著。提示实验动物病理损害的减轻、血清酶含量、肝组织中炎性细胞因子含量及动物24h死