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前言电离辐射是细胞遗传物质的强损伤剂。长期以来人们一直认为,辐射所致的生物学效应,如基因突变、染色体畸变、细胞死亡和致癌作用等是靶细胞DNA受到损伤后,自身无法修复或错配的结果,这些效应不会出现在未受照射的细胞中。辐射剂量与靶细胞效应之间具有剂量-效应关系,即辐射剂量越低,所致效应越弱。然而越来越多的研究发现,辐射所致的遗传学改变不仅出现在受照靶细胞的周围,而且可发生在位于靶细胞周围,或与靶细胞的培养液接触的未受照射的正常细胞(旁观者细胞,bystander cells)中,从而使效应明显增强。这种现象称为旁观者效应(bystander effect,BE)。由辐射引起损伤而产生旁观者效应的机制目前没有定论。其效应涉及到多种机制,不同于传统的辐射细胞效应。目前认为机制可能与受照细胞产生一些活性物质或信号分子有关。除电离辐射外,紫外线照射的靶细胞也可诱导旁观者效应。本研究中,选择UVC处理V79细胞确定其引起DNA损伤的最适照射剂量,并收集该剂量下照射靶细胞不同时段的无细胞培养液;用此无细胞培养液培养正常细胞以观察细胞DNA损伤后诱发的旁观者效应,以及所诱发的旁观者效应的类型及强度,并通过分子生物学的技术手段初步探讨UVC诱导旁观者效应的可能机制。材料和方法1、细胞培养:中国仓鼠肺成纤维细胞V79-C3细胞株于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,37℃,5%CO2孵箱内培养。2、靶细胞处理细胞在75 ml细胞培养瓶中长到75%融合后,经胰蛋白酶消化,接种至6孔板,每孔1×10~6个细胞,继续培养12h。照射前去掉培养液,每孔用2mlPBS冲洗3次,去掉PBS。紫外线光源为黑光灯,发射波长为200-290nm之间,峰值为254nm,辐射强度为9mJ/cm2,将6孔板置于距光源正下方5cm处垂直照射,设定照射剂量分别为0mJ/cm2,90mJ/cm2,1 80mJ/cm2,270mJ/cm2,540mJ/cm2,8 10mJ/cm2,照射时间分别为0s,10s,20s,30s,60s,90s。3、去细胞培养液的获取使用最适照射剂量处理V79细胞后,分别于4h、8h、12h、24h吸取培养液经0.22μm微孔滤器过滤后低温保存、备用。4、旁观者细胞细胞在75 ml细胞培养瓶中长到75%融合后,经胰蛋白酶消化,接种至6孔板,继续培养12 h后去掉培养液,用不同时点的ICM(去细胞培养液)分别继续培养细胞24h。5、检测方法(1)细胞存活率:MTT法(2)细胞形态学观察:照相显微镜观察(3)细胞坏死/凋亡检测:流式细胞仪法(4)染色体畸变:秋水仙素处理后Giema染色镜检(5)ROS活力:流式细胞仪法(6)P53 mRNA含量:TR-PCR(7)P53蛋白:免疫组化(8)旁观因子的筛选:二维电泳和飞行质谱结果1、在照射剂量为90、180、270、540、810mJ/cm~2时,v79细胞的存活率分别为65.5±4.4%、50.44±3.5%、43.4±2.7%、38.8±2.9%和29.4±1.6%。2、靶细胞的凋亡率分别为22.59±2.22%、48.89±3.67%、56.69±4.05%、64.57±4.66%和73.48±4.37%。3、在180mJ/cm2UVC照射剂量下,取出不同时段去细胞培养液用来培养正常细胞,测得v79细胞的存活率分别为61.5±3.9%、78.8±43.3%、84.2±4.1和74.9±3.7%。4、不同时段去细胞培养液作用v79细胞的凋亡率分别为20.78±2.38%、13.45±1.99%、10.51±41.53%和28.57±3.59%。5、不同时段去细胞培养液作用v79细胞染色体畸变率分别为12.33%、8.67%、5.67%和15.00%。6、不同时段去细胞培养液作用v79细胞ROS平均荧光强度分别为38.38±3.05、25.69±2.37、16.30±1.35和48.35±2.32。7、不同时段去细胞培养液作用v79细胞P53蛋白含量灰度值分别为79.05±5.23、68.36±5.12、51.81±4.35和78.65±5.67。结论1、本次研究中UVC引起旁观者效应的最适照射剂量为180mJ/cm~2。2、本次研究中UVC照射V79细胞引起的旁观者效应类型以凋亡为主。3、本次研究中UVC照射V79细胞其去细胞培养液中存在的TNF-α转换酶可能是旁观因子之一。