新生隐球菌是一种自然界中广泛存在的具荚膜的酵母型病原真菌,属担子菌纲。新生隐球菌是一种条件致病性真菌,主要感染免疫系统受损或免疫系统不健全的人群,可引起隐球菌性肺炎,经血液传播后感染中枢神经系统引起隐球菌性脑膜炎。据统计每年因新生隐球菌感染的人数达到100万,其中有60万人死亡。近年来,由于艾滋病的流行以及广谱抗生素,肾上腺皮质激素,肿瘤化疗和器官移植后免疫抑制剂的长期广泛应用,导致隐球菌脑膜炎的患病率明显增加。目前,临床上针对于新生隐球菌治疗的药物有限,加之耐药菌株的不断产生,加大了新生隐球菌感染的治疗难度。新生隐球菌因其超高的死亡率已经对人类的健康安全产生了极大的威胁。新生隐球菌有α和a两种交配型,可交配形成双核菌丝并产生担孢子。新生隐球菌主要有3个经典的毒力因子,即能产生多糖荚膜和黑色素,能在37℃条件下生长。除此之外还有许多毒力因子,比如:其分泌的超氧化物歧化酶、甘露醇等。新生隐球菌也已成为真菌遗传和致病性研究的模式生物,其有性生殖和毒力相关的重要信号途径也被广泛研究。本研究在课题组前期的研究基础上鉴定到一个毒力相关基因FRT1。通过生物信息学和分子生物学方法,分析和研究了FRT1的功能,主要包括:FRT1的时空表达情况,FRT1基因敲除、互补及超表达菌株的构建,FRT1对新生隐球菌生长发育及致病性的影响等。本研究初步阐明了FRT1在调控新生隐球菌形态发育和致病性过程中的作用。主要结果如下:1、FRT1序列分析从前期质谱数据中鉴定到一功能未知基因并命名为FRT1,序列分析发现该基因编码区全长2215 bp,含有两个很短的内含子,编码一72.3 KD蛋白。结构域分析发现Frt1蛋白含有3个ZnFC₂H₂锌指结构域,可能调控下游基因的转录、表达。2、FRT1时空表达模式分析为了探究FRT1的表达模式,我们克隆了FRT1的启动子,将其与mCherry红色荧光蛋白融合表达,利用激光共聚焦显微镜观察酵母状态和交配菌丝及孢子中的红色荧光信号。结果发现在隐球菌各个发育时期均能检测到红色荧光信号,表明FRT1启动子调控FRT1在隐球菌各个发育阶段都有表达,属组成型启动子。通过qRT-PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白水平检测FRT1在交配早期的表达情况,结果表明在交配早期FRT1的表达量随时间的延长逐渐下调。构建Frt1-mCherry、GFP-Frt1融合表达菌株,利用激光共聚焦显微镜探究Frt1的亚细胞定位,结果表明酵母形态和菌丝形态下Frt1定位在细胞质中。3、FRT1基因敲除、超表达及互补菌株的构建为了进一步研究FRT1的功能,我们采用Split Marker方法,利用基因枪转化和同源重组原理构建α交配型FRT1基因敲除突变体frt1Δ;利用新生隐球菌交配产孢的特性,通过交配,从孢子中分离a交配型frt1Δ突变体。将FRT1基因克隆到Actin启动子调控的表达载体中,经基因枪转化后构建FRT1超表达菌株FRT1^OE;构建FRT1原位互补表达载体转化frt1Δ突变体并获得FRT1互补菌株。4、FRT1基因敲除、超表达及互补菌株表型分析对上述菌株进行表型分析:frt1Δ突变体及互补菌株在在荚膜、黑色素形成以及37℃条件下生长情况与野生型菌株无差异,而超表达菌株在DMEM培养基上诱导形成的荚膜比野生型小,在37℃条件下表现出生长缺陷。应激表型检测结果显示frt1Δ突变体和超表达菌株对SDS比较敏感,对刚果红不敏感,表明Frt1可能调控新生隐球菌细胞膜完整性。交配产孢实验发现,frt1Δ突变体和超表达菌株交配能够产生交配菌丝,形成担子头,但不能形成担孢子,表明FRT1调控新生隐球菌的有性生殖过程。为进一步探究frt1Δ突变体不产孢机理,我们构建了新生隐球菌核定位蛋白Nop1与mCherry红色荧光蛋白融合表达的菌株,并通过激光共聚焦显微镜观察红色荧光蛋白的信号来探究交配菌丝中细胞核的变化。结果发现frt1Δ突变体在交配过程中细胞核能够融合,但不能进行减数分裂,表明FRT1缺失可能阻断了减数分裂过程。5、小鼠致病性分析为了检测Frt1在新生隐球菌致病过程中的作用,我们将上述菌株通过滴鼻感染的方式接种C57BL/6小鼠,每个菌株接种10只小鼠,每只小鼠接种10⁵个酵母细胞,并于接种两周后开始称重并记录小鼠存活情况,绘制小鼠存活曲线;频死小鼠经处死后解剖并摘取脑肺脾等组织和器官,分别进行组织匀浆统计组织载菌量和切片分析。致病性检测结果表明frt1Δ突变体致病性显著减弱,超表达菌株致病性完全丧失。组织载菌量结果表明超表达菌株不能侵染小鼠的大脑和脾,病理组织切片结果也与之相一致。本研究鉴定到一个新的新生隐球菌致病性相关基因FRT1,并通过基因功能分析发现Frt1可能调控新生隐球菌细胞膜完整性,并且参与了新生隐球菌致病性与有性生殖的调控。Frt1功能的分析为阐明新生隐球菌致病性和有性生殖的机制提供了帮助。