目的: 1.病原学分离 建立微量高通量、多细胞谱病毒分离模型，对脑炎患者的脑脊液标本进行分离培养，获得病毒株，为病毒鉴定和分子流行病学研究奠定基础。 2．病毒鉴定 用分子生物学方法对所分离病毒进行鉴定分型。 3．系统进化分析 应用生物信息学方法绘制病毒的系统进化树，了解病毒的地理区域性、病毒进化特征和亲缘关系，探索是否有新的基因型或血清型甚至新的病毒株的流行，为防治病毒性脑炎提供理论依据。 方法: 1．标本采集 收集山东地区病毒性脑炎患者的脑脊液或粪便标本，患者年龄在0-15岁，临床诊断排除乙型脑炎。-20℃保存备用。 2．病毒分离 将8株不同的细胞接种于96孔细胞培养板中，每种细胞接种一行，细胞长成单层后孔内接种脑脊液标本，每孔5-10μL，每份标本纵向接种8孔（8种细胞系），35℃、5％CO2培养。出现细胞病变（cytopathic effect，CPE）者传代培养两次。两次均出现CPE者视为细胞培养阳性，-70℃保存用于病毒鉴定。 3．病毒鉴定 将培养物首先用肠道病毒通用引物做逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）并测序，进行初步筛查。对确定为肠道病毒的分离株用VP1区特异引物扩增，确定型别；排除肠道病毒的分离株用随机引物进行鉴定。 4．系统进化分析 将所测得的序列与GeneBank中的已有序列进行在线比对和系统进化分析，明确病毒的科、属、型，对其可能来源进行推测；将相同疫源、相同分离时间的病毒株进行核苷酸多序列比对，并分析其氨基酸序列的变化，探讨其变异趋势。 结果: 1．103份标本中分离到62株病毒 93份脑脊液标本中有56份得到病毒培养物、10份粪便标本中有6份得到病毒培养物，总病毒分离率为60．19（62/103）。分离株均能致明显的CPE。 2．8株肠道病毒得到鉴定，其中4株为EV71 2．1 从获得培养的62株病毒中提取RNA，用肠道病毒通用引物扩增，有15份电泳后得到目的条带，其中8份经序列测定确定为肠道病毒。 2．2 其中4份用VP1引物P4S/P4A得到扩增，测序鉴定为71型肠道病毒（EV71）。 2．3 排除肠道病毒的11份分离株用随机引物扩增得到彗尾状条带，回收扩增产物、连接T载体转化DH-5a，选取10个克隆测序获得3株丙型肝炎病毒同源序列，余未获相关病毒序列；阳性克隆菌株作为片段库存，待做进一步分析。 3．系统进化分析表明所分离EV71为C4亚型 3．1 对所测得的序列进行与基因库序列在线比对、多序列比对和系统进化树分析，8份经EV通用引物鉴定为肠道病毒，分别与COX-B5、EV71型的5’非编码区同源性最高，其中4株病毒用VP1区特异引物P4S/P4A得到扩增者经序列比对鉴定为EV71，序列已提交到GeneBank，序列号依次为FJ594472～FJ594475。 3．2 在线Blast比对发现在2697-3266核苷酸区域，本课题所得序列与2008年北京分离株（Genebank序列号FJ606448．1）、安徽阜阳株（Genebank序列号EU697901．1）序列一致率均达到98％以上；分别有1～8个碱基不同程度的变异，均未发现碱基缺失。 3．3 氨基酸序列比对发现FJ594473株第155位氨基酸由呈碱性的赖氨酸变为呈酸性的谷氨酸（K→E）；FJ594474株的第136位氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸（A→T）；FJ594472株的第88位氨基酸则由苏氨酸变为丙氨酸、162位氨基酸由缬氨酸变为异亮氨酸（T→A，V→I）。 3．4 应用DNA MAN软件绘制系统进化树，发现所分离的4株EV71与2008年北京株和安徽株序列差异在5％以内，同属于C4亚型。 结论: 1．所建立的微量多细胞培养法具有简便、快速的特点，适合用于大样本量的病毒初步筛查； 2．分离到了62株病毒，其中肠道病毒8株（含4株EV71）； 3．2006～2007年山东济南、临沂地区有以肠道病毒为病原的脑炎流行；2008济南地区手足口病合并脑炎的病原为EV71 C4亚型。 4．建立了大量病毒的随机片段库，为病毒的后续基因分型奠定了基础； 5．多数病例的病原未能鉴定，推测有变异较大的肠道病毒或其它未知病毒流行。