论文部分内容阅读
矮牵牛(Petunia hybrida Vilm)花大色艳,花色丰富,广泛应用于花坛布置,景点摆设,窗台点缀,家庭装饰中,深受各国人民喜爱。在我国,随着人们生活水平的提高,对矮牵牛需求量日益增加。矮牵牛是一个杂交种,通过播种繁殖,发芽率很低,且不易保持亲本优良性状。矮牵牛和其他鲜切花一样,随着花朵的开放而迅速衰老,如何延缓花卉的衰老,延长花卉的观赏期已成为近年来专家们研究的主要课题之本研究通过克隆矮牵牛ACC氧化酶基因cDNA片段,拟构建其RNAi表达载体,转入到矮牵牛愈伤组织中,通过组织培养再生体系,获得完整的再生植株。本研究以矮牵牛子叶为材料,筛选出了矮牵牛组织培养各阶段的适宜培养基,成功地获得了矮牵牛组织培养再生植株,建立了矮牵牛组织培养植株再生体系；以矮牵牛衰老花瓣为材料,提取了花瓣组织总RNA,通过特异引物RT-PCR,克隆到矮牵牛ACC氧化酶基因cDNA片段,为进一步研究奠定了基础,本研究取得的主要成果如下：1.建立了矮牵牛组织培养再生体系(1)矮牵牛种子消毒本研究采用了二次化学试剂消毒法,75%乙醇和0.1%升汞组合使用,这两种试剂最适消毒消毒时间分别为30s与8min;(2)矮牵牛子叶诱导愈伤组织发生和增殖的最适培养基都为MS+1.Omg/L 6-BA +0.5mg/L NAA;(3)矮牵牛子叶愈伤组织诱导不定芽发生的最适培养基为MS+0.5mg/L 6-BA +0.2mg/L NAA;(4)不定芽增殖和生根的最适培养基都为1/2MS;(5)矮牵牛苗移栽最适基质为泥炭土：珍珠岩=1：1,移栽存活率可达66.7%;(6)矮牵牛愈伤组织Hyg抗性筛选最适浓度为lOmg/L。2.建立了适合矮牵牛衰老花瓣总RNA提取的改良Trizol试剂法在传统Trizol试剂法基础上,对其进行改良。结果表明,改良的Trizol试剂法能有效去除矮牵牛衰老花瓣中色素等物质,28S和18SrRNA条带清晰可见,亮度比在1.0-2.0之间,OD260/OD280平均值为1.75,OD260/OD230平均值为1.91。3.矮牵牛ACC氧化酶基因cDNA片段的获得以矮牵牛衰老花瓣为材料,提取矮牵牛衰老花瓣总RNA；经RT反转录合成了第一链cDNA;根据ACC氧化酶的保守序列,设计合成了一对特异引物；经PCR扩增和克隆,得到矮牵牛ACC氧化酶基因cDNA特异片段；在NCBI网站上进行Blast比较,该片段具有高度保守性,与矮牵牛ACC氧化酶基因家族同源性最高达到100%,最低也超过80%,将该片段的互补序列编码的173个氨基酸序列在NCBI网站上进行Blast比较,结果发现,该片段互补序列编码的氨基酸序列与显示的100条ACC氧化酶氨基酸序列同源性为100%的有98个,99%的有1个,91%的有1个。